高中生物《第五章 第二节 多聚酶链式反应扩增NDA片段》课件6 新人教版选修1.ppt

多聚酶链式反应扩增dna片段 衡阳市一中吴世玉 学习目标 1 尝试pcr dna多聚酶链式反应 技术的基本操作 2 理解pcr的原理和反应过程 3 讨论pcr的应用 基础知识 一 dna分子的结构 1 dna分子的基本组成单位 2 脱氧核苷酸的结构模式 脱氧核糖核苷酸 简称脱氧核苷酸 基础知识 一 dna分子的结构 3 多脱氧核苷酸链的结构模式 dna的羟基 oh 末端称为3 端 而磷酸基团的末端称为5 端 基础知识 二 pcr原理 请阅读 教材 p58内容 分析 1 dna复制需要哪些基本条件 它们分别起什么作用 解旋酶 打开dna双链 dna母链 提供dna复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成子链的原料 dna聚合酶 催化合成dna子链 引物 使dna聚合酶能够从引物的3 端开始连接脱氧核苷酸 基础知识 二 pcr原理 请阅读 教材 p58内容 分析 3 dna聚合酶的作用有何特性 dna聚合酶不能从头开始合成dna 而只能从3 端延伸dna链 因此 dna复制需要引物 2 什么是引物 若要克隆dna 需要加入几种特定的引物 提示 引物是指能与dna母链的一段碱基序列互补配对的一小段dna或rna片段 克隆dna时应加入两种引物 基础知识 二 pcr原理 请阅读 教材 p58内容 分析 4 为什么dna的合成方向总是从子链的5 端向3 端延伸 dna聚合酶不能从头开始合成dna 而只能从3 端延伸dna链 当引物与dna母链通过碱基互补配对结合后 dna聚合酶就能从引物的3 端开始延伸dna链 基础知识 二 pcr原理 请阅读 教材 p58内容 分析 5 在生物体外如何将dna的双螺旋打开 dna的热变性原理 在80 1000c的温度范围内 dna的双螺旋结构将解体 双链分开 这个过程就称为变性 当温度缓慢降低后 两条彼此分离的dna链又会重新结合成双链 这称为复性 pcr就是利用了dna的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解聚与结合 基础知识 二 pcr原理 请阅读 教材 p58内容 分析 6 高温能将将dna的双螺旋打开 但同时也可能使dna聚合酶失活 怎么办 耐高温的taqdna聚合酶的发现和应用解决了以上矛盾 基础知识 二 pcr原理 小结 pcr反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行 并需要提供 dna模板 两种引物 四种脱氧核苷酸 耐热的dna聚合酶 如taqdna聚合酶 同时通过控制温度使dna复制在体外反复进行 基础知识 pcr一般要经历30多次循环 每次循环可以分为三步 变性 复性和延伸 在循环之前常要进行一次预变性 目的是增加模板dna彻底变性的概率 二 pcr的反应过程 基础知识 二 pcr的反应过程 1 变性 当温度上升到 0c以上时 双链dna解聚为单链 2 复性 温度下降到 0c左右 两种引物通过 与两条单链dna结合 3 延伸 温度上升到 0c左右 溶液中的四种脱氧核苷酸在 的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna链 90 50 碱基互补配对 72 dna聚合酶 基础知识 从第二轮循环开始 上一次循环的产物也可以作为模板参与反应 并且由引物 延伸而成的dna单链会与引物 结合 进行dna的延伸 dna聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的dna序列 使这段固定长度的序列呈指数扩增 二 pcr的反应过程 383 实验操作 一 设备及用具 pcr仪 微量离心管 微量移液器等等 二 pcr仪的循环程序 预变性的目的 增加模板dna彻底变性的概率 操作提示 阅读教材p62 结果分析与评价 dna在260nm的紫外线波