鸭胚肝组织微囊藻毒素的富集及检测.doc

鸭胚肝组织微囊藻毒素的富集及检测摘要：近年来湖泊富营养化和蓝藻水华爆发已成为严重的环境问题。在有毒蓝藻水华产生的毒素中，微囊藻毒素（MC）是分布最广、毒性最大的种类之一。MC既可通过饮用水进入人体，也可在浮游生物、水生无脊椎动物和鱼体中积累，并能通过食物链威胁到人类健康。本实验用0.1g/egg的微囊藻毒素浓度来处理鸭胚，用固液萃取进行纯化富集，最后通过ELISA检测肝中所含MC的量，来研究微囊藻毒素在鸭胚肝脏中的富集情况。研究结果表明：微囊藻毒素会对鸭胚生长发育造成影响，毒素剂量大于等于1g/egg时会致死。关键词：微囊藻毒素，固液萃取，肝脏Concentration of Microcystin and its Testing in Duck Embryo Liver07093215 LIU Min（Qiuzhen School of Huzhou Teachers College, Huzhou 313000 ）Abstract: In recent years, lake eutrophication and cyanobacterial bloom has become a serious environmental problem. In the toxins produced by cyanobacterial blooms, microcystin (MC) is one of the most widely distributed and toxic species. MC can enter the body through drinking water, also can accumulation in the plankton, aquatic invertebrates and fish, and can threat to human health through the food chain. In this paper, the concentration of 0.1g/egg to deal with duck embryo, purified and enriched by solid-liquid extraction, and finally to detected the amount of MC contained in the liver by ELISA, to study the microcystin concentration in duck embryo liver. The results showed that microcystins affected the growth and development of duck embryo, when the pure toxin doses greater than or equal 1g/egg, the duck embryo had died.Key words: microcystins, solid-liquid extraction, liver目 录1 前言12 材料与方法12.1实验材料12.1.1 藻种2.1.2 种鸭蛋2.1.3 ELISA试剂盒2.1.4 化学药品和试剂 2.1.5 主要仪器和设备 2.1.6 其他实验用具及主要器皿2.1.7 酶标仪设置2.2实验方法和步骤32.2.1 鸭胚的处理2.2.2 鸭胚中肝脏的分离2.2.3 肝中微囊藻毒素的提取与制备2.2.4 ELISA检测鸭胚肝脏中毒素含量3 结果63.1鸭胚的结果6 3.1.1 鸭蛋的平均重量 3.1.2 MC处理后鸭胚的死亡情况 3.1.3 鸭胚发育过程和解剖特性3.2肝中微囊藻毒素的检结果9 3.2.1 酶标仪读板得到数据和拟合曲线图 3.2.2 肝中微囊藻毒素浓度的检测结果 4 讨论 135 总结与展望 15参考文献 16致 谢 17- 1. 前言近年来，由于环境保护和治理措施的不足，我国越来越多淡水湖泊、人工水库出现日趋严重的富营养化，每年都有大面积蓝藻水华现象的爆发，对人类的正常生活造成了很大的影响。如2007年太湖蓝藻提前大面积暴发， 腥臭湖水直接污染了无锡南泉自来水厂水源地，形成了一次严重的水危机。除了中国外，世界各国湖泊池塘中都发现有微囊藻形成的水华，可见它危害大，分布广，持续时间长，发生频率高。当蓝藻水华出现时，水面被厚厚的蓝绿色湖靛覆盖，不仅对环境造成严重的破坏，而且藻细胞破裂后释放出了多种藻毒素严重威胁了人和动物的健康。水华藻类及其毒素已被列入微生物和有机污染物的检测项目1。微囊藻毒素(Microcystins）是蓝藻水华污染中出现频率最高，产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。微囊藻毒素主要是一种具生物活性的单环七肽毒素，它是由多种淡水蓝细菌产生的，其结构可表示为：环D -丙氨酸-L -X -赤- -甲基-D-异天冬氨酸-L -Z -Adda -D -异谷氨酸-N-甲基脱氢丙氨酸，其中X和Y是两个可变的氨基酸，D-甲基天冬氨酸，脱氢丙氨酸，烯酸依次是D-赤-b-甲基天冬氨酸，N-甲基脱氢丙氨酸，(2S, 3S, 8S, 9S)-3-氨酸-9-甲氨酸-2, 6, 8-三甲基-10-苯癸-4, 6-二烯酸的缩写。由于目前大多数水体都存在污染的情况，因此MC成为一种存在广、影响大的天然毒物。据调查发现一些地区作为饮用水源的地表水中，甚至在自来水中也能检出MC。MC会堆积在水产品品中，然后被人们做成菜吃进口中，继而MC会在人体中堆积，近年来很多研究表明MC在水产动物的各种器官（主要是肝脏、胰腺、消化道、性腺、卵、肌肉等）中积累，也可以沿食物链传递，对人体和其各组织器官存在潜在的危险，其积累和作用的组要靶器官是肝脏，其次是性腺。有文献报道微囊藻毒素可通过对肝脏中的肝细胞和肝巨噬细胞的作用，抑制肝细胞中蛋白磷酸酶的活性，诱发巨噬细胞中肿瘤坏死因子和白细胞介素1，导致疾病产生；高浓度时，可引起急性反应如肝炎症、肝出血，甚至肝坏死2。家畜及野生动物饮用了含藻毒素的水后，会出现腹泻、乏力、厌食、呕吐、嗜睡、口眼分泌物增多等症状，甚至死亡。病理病变有肝脏肿大、 充血或坏死，肠炎出血、肺水肿等34。通过饮用或接触被MC或其它有毒藻毒素污染的饮用水或娱乐用水而引起的患病风险，已经作为一个世界关注的环境卫生问题，引起世人的关注59。本实验以樱桃谷种鸭蛋作为实验动物，将购买的受精蛋用清水洗净后擦干，用打孔针在鸭蛋中部远离胚胎处打一小孔，用注射器注入相应的微囊藻毒素于卵黄中，然后立即用石蜡封口，继续在38左右的环境中孵化，于不同发育期处死并分离鸭胚肝组织，通过固液萃取进行纯化富集，最后用ELISA检测肝中所含MC的量，来研究微囊藻毒素在肝脏中的富集情况。2. 材料与方法2.1 材料2.1.1 藻毒素微囊藻毒素购于北京伊普瑞斯科技有限公司。2.1.2 种鸭蛋 樱桃谷鸭受精鸭蛋购于湖州塘甸建华种禽厂。对照组种鸭蛋是从8月份购买，实验组种鸭蛋是从10月份购买。2.1.3 ELISA试剂盒微囊藻毒素检测试剂盒购于Beacon公司。2.1.4 化学药品和试剂表2-1 主要的化学药品和试剂名称纯度来源氯化钠分析纯上海试剂总厂甲醇分析纯上海试剂总厂无水乙醇 分析纯 杭州萧山化学试剂厂苯扎溴铵分析纯南昌白云药业有限公司95%乙醇分析纯 杭州萧山化学试剂厂甲醇色谱纯韩国SK化学公司石蜡（熔点是60-62）试剂上海经济区如皋市红旗玻璃厂2.1.5 主要仪器和设备表2-2 主要的仪器和设备名称型号制造商或产地海信BCD206H 冰箱海信集团有限公司立式压力蒸汽灭菌锅上海博迅实业有限公司医疗设备厂电子天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司SPX-250B-G 微电脑光照培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂生物体视显微镜S27日本OLYMPUS公司C18高效液相色谱柱美国Waters公司Grumbach 孵化器南京皓海仪器仪表有限公司电热鼓风干燥箱 101A-2上海浦东荣丰科学仪器有限公司超级恒温水槽 DKB-501A上海森信实验仪器有限公司高速离心机 CR22G/CR21G天美科技有限公司伯乐680 型酶标仪BIO-RAD公司SZ-97自动三重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂JY96- 超声波细胞粉碎机宁波新芝生物股份有限公司2.1.6 其他实验用具及主要器皿温度计，EP管，各种量程移液枪，铅笔，眼科镊子，解剖刀，解剖针，解剖剪，戳蛋锥，泡沫盒，泡沫板，保鲜薄膜，封口膜，培养皿，吸水纸，标签纸，纱布，酒精灯，吸水纸，滤纸，称量纸，各种量程的烧杯、量筒及容量瓶，脸盆，100mL量筒，50mL量筒，锥形瓶，培养瓶，试管，试管架，一次性注射器。2.1.7 酶标仪设置 接上电源，打开机器后面的开关，机器开启自检后，根据仪器上的提示输入密码“00000”后，按输入键即可进入机器的操作界面。 在电脑屏幕上打开酶标仪软件，如果试验的程序已编好，则可直接调出在储存的程序直接读板。如试验的程序需重新编辑，则选择添加新检测项目进行新程序的设置。 由于是定量实验选择定量后，根据试剂盒所所配进行标准品浓度设置。 选择单波长，450 nm。 读数的方式为步进。 存为模板 排板：手工排板，按照检测中个样品的排列方式准确设置各孔，并设置一个空白孔。基本包括阴性对照，标准品，阳性对照，空白四类。 检测品放入酶标仪，按读板，即可检测。（9）检测数据出来后，选择“拟合曲线”（10）在出来后的表中输入标准品的浓度，按拟合，即可出来标准品的曲线方程。2.2 实验方法及步骤2.2.1 种鸭蛋的处理（1）蛋的清洗及消毒洗蛋因产蛋过程和存放、运输等原因，蛋壳粘有许多粪便、泥土和细菌，因此，必须进行清洗。洗蛋方法是将蛋同筐一起放入洗水槽内，用手洗擦蛋壳或用洗蛋洗蛋。洗净的蛋，再用流动清水冲洗一次。清洗后用苯扎溴铵对蛋壳进行消毒，以使蛋壳表面细菌数减少到最低限度。蛋取出后，应用水淋1分钟或温水浸泡片刻，以除去蛋壳表面的余氯。也可用0.4浓度的氢氧化钠溶液，浸泡5分钟进行消毒。经消毒冲洗后的鸡蛋，用干纱布擦干。（2）称重及注射 种鸭蛋的平均重量通过对樱桃谷种鸭蛋的称量，得出对照组平均蛋重73.161.00g；实验组平均蛋重81.452.31g。 注射剂量经预实验确定实验组注射剂量为0.1g/egg，即每个实验组种鸭蛋注射0.1g微囊藻毒素50L。每个对照组种鸭蛋注射生理盐水50L（3）实验设计 考虑到夏天种鸭蛋的受精率只有大约50%，为了节省藻毒素，先将种鸭蛋孵化至3 天（可以看见卵黄囊血管区），待观察到胚胎活动时再注射藻毒素。 实验组100枚注射0.1g微囊藻毒素50 L，对照组40枚只注射生理盐水50 L。每天照蛋检查1次统计鸭胚的死亡率。孵化13、17、21、25、29天时每次处死5只，共5次。测量实验组和对照组鸭胚的发育情况，分离肝，称重后置-20保存待用。取0.12g肝脏组织，提取并纯化MC，ELISA检测MC含量。（4）鸭胚孵化参数 温度1-14 天胚龄38.5 ,14-25 天胚龄37.5 ,27-28 天胚龄37.2 。 相对湿度1-7 天胚龄65-70 %，8 -26 天胚龄55 -60%，27 -28 天胚龄70 -75%。（5）鸭胚孵化鸭蛋离开母体以后，产出来的蛋在23以下的环境，胚胎发育基本处于静止状态。本实验将购买的受精蛋用清水洗净后擦干，用打孔针在鸭蛋空泡面戳穿小孔，用注射器注入相应的微囊藻毒素于卵黄处，然后立即用石蜡封口继续孵化。将受精蛋置于38左右进行孵化，胚胎就继续发育。2.2.2鸭胚中肝脏的分离取材：用镊子拨开蛋壳空泡面，取出鸭胚，分离肝脏（如图2-1可清楚的找到肝脏的分布位置）。再将同一天的鸭胚中的肝脏放入同一个EP管中并贴上标签，放入-20冰箱中保存待用。图2-1 鸭胚解剖直观图1. 性腺；2. 左肾的后部；3. 输卵管分泌部；4. 子宫部；5. 阴道部；6. 泄殖腔；7. 心脏；8. 左肺；9. 肝脏；10. 腺胃；11. 肌胃；12. 小肠；13. 盲肠。2.2.3肝中微囊藻毒素的提取与制备取0.12 g匀浆后的肝脏组织，加入85甲醇水溶液1mL，超声提取10 min(频率：50 kHz，功率：100 W)，10 000 rmin离心10 min，移取上层清液，沉淀再次抽提(方法同前)，合并上清液，于48干燥箱中烘至上清液基本蒸发完，但不能完全干燥。加100L生理盐水重悬。将已加入100L生理盐水重悬液通过已用5ml 100%的甲醇、5ml去离子水预活化好的C18固相萃取柱，让其自然流下，过柱速度约为3 mLmin，用100甲醇溶液5 mL将MC洗脱至试管中，置于48干燥箱中烘干至上清液基本蒸发完，但不能完全干燥。加100L生理盐水重悬。2.2.4 ELISA检测鸭胚肝脏中毒素含量 Beacon 微囊藻毒素检测试剂盒适用于水中微囊藻毒素的定量检测。 检测原理Beacon 微囊藻毒素检测试剂盒由可以和微囊藻毒素及微囊藻毒素酶标记物结合的多克隆抗体制成。样品中的微囊藻毒素与微囊藻毒素酶标记物竞争结合数量有限的抗体结点。检测过程中，先加入微囊藻毒素酶标记物及含有微囊藻毒素的样品到测试孔中接着加入抗体，酶标记物与样品中的微囊藻毒素竞争结合同样的抗体的结合点。测试孔中包被有抗兔IgG，用于捕获加入的兔抗微囊藻毒素抗体。孵育30min后洗掉小孔中所有没有结合的分子。每孔中加入干净的底物溶液，连接的酶结合物可以将底物转化成蓝色化合物，一个酶分子可以转化多个底物分子。由于各个孔中抗体可结合位点是相同的，并且加入的微囊藻毒素酶标记物的量也是相同的，样品中微囊藻毒素含量低的则酶标记物结合得多，颜色会显深蓝色。反之，样品中微囊藻毒素含量高的则酶标记物结合得少，颜色会显浅蓝色。注意：颜色与微囊藻毒素的含量成反比。较深的颜色=较低的浓度较浅的颜色=较高的浓度特异性Beacon 微囊藻毒素检测试剂盒没有区分微囊藻毒素-LR（作为标准品）及其他类型，然而可以测到微囊藻毒素的其它类型，以下表格中展示的相关值及交叉反应率（%CR），以下所有浓度均为ppb级。表2-3 表 2-3 不同种类微囊藻毒素交叉反应率种类%CR微囊藻毒素-LR100微囊藻毒素-RR87微囊藻毒素-YR48Nodularin31 试剂盒组成 包被有羊抗兔抗体的的微孔板 （12 8 条） 阴性对照品一瓶（0ppb 微囊藻毒素-LR） 0.1 ppb, 0.3 ppb, 0.8 ppb, 2 ppb微囊藻毒素-LR 标准品各一瓶 1.0ppb微囊藻毒素-LR质量控制液一瓶 微囊藻毒素HRP 酶标记物一瓶 兔抗微囊藻毒素抗体溶液一瓶 底物一瓶 停止液一瓶（注意:1N 盐酸，小心处理） 100 清洗液 检测程序 将所有试剂及样品置于室温下。 从铝箔袋中拿出要求数量的微孔条，放入干燥剂并重新封好袋子以免微孔条受潮。 稀释100倍浓缩清洗液为1倍清洗液，例：取5mL100倍清洗液到500mL洗瓶中并加入495mL蒸馏水。将过柱后的浓缩液（13天、17天、21天、25天、29天的肝脏组织样品及对照组样品）分别定容到200L。 吸取50L酶标记物到微孔板的每个孔中。 吸取50L标准，阴性对照，样品到对应微孔中，各孔依次为阴性对照、0.1ng/mL标准品、0.3ng/mL标准品、0.8ng/mL标准品、1.0ng/mL标准品、2.0ng/mL标准品和样品（13天、17天、21天、25天、29天的肝脏组织样品及对照组样品）。 加入50L抗体溶液到每个小孔中。快速震荡使孔中的溶液混合，并敷上薄膜，或者微孔板可以放在振荡器上震荡孵育，从而达到在孵育期间持续震荡的效果，孵育30 min。 孵育完后，去掉封口膜将微孔中的溶液倒入水槽中，用1倍清洗液完全充满微孔进行清洗，震荡后倒掉，重复四次，总共五次洗板。在吸水纸上拍打，尽可能将水拍干。 每个微孔中加入100L底物溶液，盖上小孔并孵育30 min 按照加底物的顺序每孔中加入100L停止液。停止液为1N盐酸，需小心操作 450nm下，酶标仪自动读板，处理数据，并拟合曲线3. 结果3.1鸭胚的结果3.1.1种鸭蛋重量统计对照组（8月）与实验组（10月）种鸭蛋重量用SPSS 13.0 统计软件统计分析得存在显著性差异。表3-1 对照组与实验组种鸭蛋重量差异显著性分析组别重量（平均值标准差）对照组（8月）73.161.00实验组（10月）81.452.31由统计分析可知，P=0.0040.05，对照组与实验组种鸭蛋重量存在显著差异，对照组平均蛋重73.161.00g，实验组平均蛋重81.452.31g。虽然本次实验中对照组与实验组的种鸭蛋不是同一批购买的且存在显著差异，但此实验我们研究的是一定量MC在鸭胚肝组织中的分布，即不同孵化天数时，鸭胚吸收并在肝组织中所积累的微囊藻毒素的量，所以我们对照组与实验组存在的重量上的差异对本实验无明显影响。3.1.2 MC处理后鸭胚的死亡情况表3-2 不同孵化天数鸭胚的死亡率组别不同胚龄的死亡率5天9天13天17天21天25天29天总死亡率对照组05.00%9.09%0013.33%12.50%2.00%实验组14.00%17.44%39.39%14.29%12.00%17.65%28.57%70.00%图3-1不同孵化天数鸭胚死亡率3.1.3 鸭胚发育过程和解剖特性鸭的胚胎发育分两个阶段：第一阶段是在母体内进行的。由于母鸭体内温度非常适合胚胎发育，受精卵在输卵管的峡部开始卵裂，并发育成一个多细胞的胎盘。第二阶段是在鸭蛋离开母体以后进行的。产出来的蛋在23以下的环境，胚胎发育基本处于静止状态。如将受精蛋置于适当环境里进行孵化，胚胎就继续发育。家鸭一般孵化期为28天。鸭胚胎发育过程和特征见下表。表3-3 鸭胚胎发育的过程与特征鸭蛋孵化天数（天）照蛋时的特征胚蛋解剖时的特征3已经可以看见卵黄囊血管区，其形状很像樱桃，故称“樱桃珠”未解剖5蛋转动时，卵黄不易跟随转动，俗称“钉壳”。胚胎和卵黄囊血管形状像一只小的蜘蛛，故又称“小蜘蛛”未解剖7胚胎形似“电话筒”，一端是头部，另一端为弯曲增大躯干部，俗称“沉”。正面已布满扩大的卵黄和血管未解剖9正面：胚胎较易看到，像在羊水中浮游一样，俗称“浮”背面：卵黄扩大到背面，蛋转动时两边卵黄不易晃动，俗称“边口发硬”未解剖13尿囊血管继续伸展，在蛋的小头合拢，整个蛋除气室外布满血管，俗称“合拢”、“长足”胚胎的头部偏向气室，眼裂缩小，喙具一定形状，爪角质化，全部躯干覆以绒羽。尿囊在蛋的小头完全合拢16小头发亮的部分随着胚胎日龄的增加逐渐缩小未解剖17小头发亮的部分逐渐缩小，蛋内黑影部分则相应增大，说明胚胎身体在逐日增长胚胎头部位于翼下，眼睛已被眼睑覆盖，横着的位置开始改变，逐渐与长轴平行。卵黄与蛋白明显减少，羊膜及尿囊中液体减少21以小头对准光源，看不到发亮的部分，俗称“关门”、“封门”胚胎嘴上的鼻孔已成形，小头蛋白已全部输入羊膜囊中，蛋壳与尿囊极易剥离，照蛋时看不到小头发亮的部分23气室朝一方倾斜，这是胚胎转身的缘故，俗称“斜口”、“转身”未解剖续表 3-2鸭蛋孵化天数（天）照蛋时的特征胚蛋解剖时的特征25气室内可以看见黑影在闪动，俗称“闪毛”胚胎两腿弯曲朝向头部，颈部肌肉发达，同时大转身，颈部及翼突入气室内，准备啄壳。卵黄绝大部分已进入腹中，尿囊血管逐渐萎缩，胎膜完全退化27起初是胚胎喙部穿破壳膜，伸入气室内，称为“起嘌”、“啄壳”未解剖29出壳出壳雏鸭出生重一般为蛋重的65%-70%，腹中尚存约有5克卵黄3.2肝中微囊藻毒素的检测结果3.2.1酶标仪读板得到数据和拟合曲线图 （1）第一次ELISA检测图3-2 ELISA检测标准曲线由软件通过曲线拟合的标准曲线公式为：y=2.0639-2.0619*x, 相关系数为: -0.8749，其中x为吸光度。由公式计算可得MC溶液在不同胚龄的鸭胚肝脏组织中的浓度。（2）第二次ELISA检测图3-3 ELISA检测标准曲线由软件通过曲线拟合的标准曲线公式为：y=0.0464-2.7671*lg(x)，相关系数为：0.9353，其中x为吸光度。由公式计算可得MC溶液在不同胚龄的鸭胚肝脏组织中的浓度。(3) 第三次ELISA检测图3-4 ELISA检测标准曲线由软件通过曲线拟合的标准曲线公式为：y=-0.5195-3.0316*lg(x)，相关系数为：0.9245，其中x为吸光度。由公式计算可得MC溶液在不同胚龄的鸭胚肝脏组织中的浓度。（4）第四次ELISA检测图3-5 ELISA检测标准曲线由软件通过曲线拟合的标准曲线公式为：y=-0.3357-3.4367*lg(x)，相关系数为：0.9399，其中x为吸光度。由公式计算可得MC溶液在不同胚龄的鸭胚肝脏组织中的浓度。3.2.2肝中微囊藻毒素浓度的检测结果 （1）第一次ELISA检测表3-4 ELISA检测结果（肝脏n=5）样品/标准品OD值浓度(g/l)取样量(g)阴性对照0 mg/mL1.357-0.734标准品0.1 mg/mL1.076-0.1550.3 mg/mL0.7050.6100.8 mg/mL0.4241.1901.0 mg/mL0.3471.1382.0 mg/mL0.2471.555实验组样品13天胚龄0.8440.3240.1217天胚龄0.9680.0680.1221天胚龄0.7960.4230.1225天胚龄0.6630.6970.1229天胚龄0.8920.2250.12对照组样品25天胚龄0.6310.7630.12（2）第二次ELISA检测表3-5 ELISA检测结果（肝脏n=5）样品/标准品OD值浓度(g/l)取样量(g)阴性对照0 mg/mL1.514-0.452标准品0.1 mg/mL1.133-0.1070.3 mg/mL0.7490.3940.8 mg/mL0.4411.0301.0 mg/mL0.3741.3182.0 mg/mL0.2631.652对照组样品25天胚龄0.7580.3790.12（3）第三次ELISA检测表3-6 ELISA检测结果（肝脏n=5）样品/标准品OD值浓度(g/l)取样量(g)阴性对照0 mg/mL0.927-0.420标准品0.1 mg/mL0.727-0.0990.3 mg/mL0.5010.8580.8 mg/mL0.3031.0531.0 mg/mL0.2621.2442.0 mg/mL0.1981.613实验组样品13天胚龄0.5490.2700.1217天胚龄0.818-0.2550.1221天胚龄0.5970.1600.1225天胚龄0.5700.2210.1229天胚龄0.754-0.1480.12对照组样品25天胚龄0.4380.5670.12（4）第四次ELISA检测表3-7 ELISA检测结果（肝脏n=5）样品/标准品OD值浓度(g/l)取样量(g)阴性对照0 mg/mL1.037-0.390 续表 3-7样品/标准品OD值浓度(g/l)取样量(g)标准品0.1 mg/mL0.847-0.0880.3 mg/mL0.6210.3750.8 mg/mL0.4120.9881.0 mg/mL0.3431.2612.0 mg/mL0.2621.663实验组样品13天胚龄0.7230.1480.1217天胚龄0.858-0.1070.1221天胚龄0.6570.2910.1225天胚龄0.6280.3590.1229天胚龄0.7750.0450.12对照组样品25天胚龄0.6760.2490.124. 讨论微囊藻毒素是细胞内毒素，在细胞内合成，细胞破裂后释放出来，是一种肝毒素，这种毒素是肝癌的强烈促癌剂，能导致肝坏死、出血或凋亡。人类饮用或直接接触藻类污染的水体会引起皮肤反应、腹泻、肠胃炎等症状，长期饮用可能会引发肝癌，很多研究发现饮水中微量MCs与人群中原发性肝癌的发病率有很大相关性。1996 年, 在巴西发生了一起严重的医疗事故，由于肾透析用水被 MC(-LR、-YR 和-AR)污染导致 52 人死亡10。近年来，我国湖泊水库富营养化发展速度相当快，频繁暴发蓝藻水华现象，滇池、太湖、武汉东湖、等水体均发现含有MCs。实验通过用微囊藻毒素来处理鸭胚，用固液萃取进行纯化富集，最后通过ELISA检测肝中所含MC的量，研究微囊藻毒素在鸭胚肝脏中的富集情况。本实验所使用的微囊藻毒素（MC）购于北京伊普瑞斯科技有限公司，其纯度较高，所含的杂质蛋白质少。由于首次使用这种纯种的微囊藻毒素，对它的毒性并不了解，很难确定处理鸭胚的用量，所以需进行一些预处理来确定注射剂量。我们以先前实验为依据，先确定每个蛋注射浓度为16g的微囊藻毒素50L，观察发现一个星期左右几乎所有实验组的种鸭蛋都死亡了，而对照组确定受精的种鸭蛋生长情况较好，只有少数死亡。第二次我们减少注射微囊藻毒素的浓度，每个蛋注射浓度为10g的微囊藻毒素50L，观察发现一个星期左右几乎所有实验组的种鸭蛋都死亡了，因为第一次对照组死亡量较少，排除种鸭蛋本生存活率低的因数，所以这次没有设置对照组。又注射了8g/egg、3g/egg的浓度，观察发现存活率依然很低，几乎为0。对照前几次的预实验，考虑注射因数引起实验组存活率低，准备再做一次对照组，每个蛋注射50L生理盐水，同时另一批蛋注射浓度为1g的微囊藻毒素50L，观察发现对照组存活率依然较高，实验组情况和前几次相似，说明并不是注射时染菌造成实验组存活率低，排除了这个因数，所以之后不设立对照组。最后采用每个蛋50L注射0.1g的微囊藻毒素浓度，观察发现实验组蛋的存活率明显上升，可进行下一步实验。通过多次预实验，我们发现0.1g/egg能对鸭胚起毒性作用而不是致死剂量，所以我们采用0.1g/egg的剂量来处理种鸭蛋。由于三日龄的鸭胚血管区不明显，所以我们采用四日龄的鸭胚。但如果长时间将打孔过的鸭蛋放置而未对其进行藻毒素的注射，胚胎会浮游到打孔处，因此注射藻毒素的过程要小心快速。在第一次ELISA检测肝脏组织中微囊藻毒素量的结果中，对照组中肝脏组织中检测出较大量的微囊藻毒素。根据桂佳等的研究11并分析数据得知在绘制拟合曲线时应把1.0ng/mL标准品输入到绘制标准曲线的表格中，即共5个标准品，而本次实验只把1.0ng/mL标准品作为微囊藻毒素-LR质量控制液，没有输入到表格中，所以测出来的相关系数较低，导致这次检测失败。第二次ELISA检测针对对照组检测出微囊藻毒素的情况做的，这次改进上次的步骤，虽然还是测出微囊藻毒素，不过其含量有明显减少。参照两次检测出的结果，考虑各方面的因素，想到我们使用的ELISA试剂盒已使用了近一年，有可能是试剂盒时间太长导致实验失败，进而进行了第三次ELISA检测。第三次检测结果中，对照组肝脏组织中微囊藻毒素浓度比第二次测出来要高，且由于操作上犯了粗心的错误，此次结果不在考虑中。第四次检测对照组肝脏组织中含量是四次中最少的，但依然含有，证明实验还是有失误的地方。从这三次ELISA检测中观察，微囊藻毒素含量存在一些规律，即17天和29天的含量较小，且17天最少，13天，21天，25天中含量递增。由于ELISA检测进行了四次且对照组中都能检测到微囊藻毒素，所以确定不是由ELISA检测造成实验结果的不正确。通过实验步骤的分析，推测有可能是肝脏组织中微囊藻毒素的纯化有失误。本实验我们采用的是美国Waters公司生产的C18高效液相色谱柱，将已加入100L生理盐水的浓缩液通过已用5ml100%的甲醇、5ml去离子水预活化好的C18高效液相色谱柱，过柱速度约为3 mLmin，用100甲醇溶液5 mL将MC洗脱至试管中，置于48干燥箱中烘干至半干后检测。对比我们所做的步骤，翻查了许多文献，发现我们在操作中少了淋洗这一重要步骤。由文献得知固相萃取（SPE柱）在洗脱前应用适当的溶液进行淋洗，可以减少杂质及其对目标物的干扰12。对于低浓度的微囊藻毒素的检测，若不进行淋洗伴随洗提洗脱下来的非毒素物质是一个主要干扰13。在进行微囊藻毒素的纯化时，活的SPE柱没有经过淋洗而直接洗脱，这样不但微囊藻毒素被洗脱下来，还带下来了许多原肝脏组织中的杂质蛋白，最终造成对照组和实验组一样检测出较大的浓度且它们的浓度比注射进鸭胚中的微囊藻毒素剂量（0.1g/egg）要大。我们认为，正确的步骤应该是：将已加入100L生理盐水的浓缩液通过已用5ml100%的甲醇、5ml去离子水预活化好的C18高效液相色谱柱，过柱速度约为3 mLmin，先后用超纯水和20%甲醇溶液各5ml淋洗C18柱去除杂质，90甲醇溶液（含0.1%TFA (0.1/100ml):三氟乙酸）5 mL将MC洗脱至试管中，置于48干燥箱中烘干至半干后检测。通过本实验，我们初步建立了鸭胚组织中微囊藻毒素的检测方法，尽管本实验过程中出现了许多问题。通过多次反复的操作、翻找资料、推敲，我们总结了实验中存在的问题，也学到了很多知识，但由于时间有限，进一步的结论只能由学弟学妹来完成了，希望我们的经验能给大家做一个参照，避免在实验中碰到类似的失误。5. 总结微囊藻毒素是由淡水蓝绿藻产生的一类最常见的环七肽缩氨酸肝毒素，它们过抑制蛋白质磷酸酶的活性产生强烈的促肝癌作用，对人和其它生物产生较大威胁14。人类长期饮用含有微量MCs的水，将会导致原发性肝癌15。微囊藻毒素通过饮用水或食用水产品在人体中堆积，也可以沿食物链传递，对人体和其各组织器官存在潜在的危险。本实验主要研究了鸭胚肝脏组织中微囊藻毒素的固液萃取，并初步建立了鸭胚组织中MC的检测方法。参考文献1 Susan DR. Water analysisJ. Anal Chem, 1999, 71(2): 181-2152 李效宇, 宋立荣, 刘永定. 微囊藻毒素的产生、检测和毒理学研究J.水生生物学报, 1999, 5: 517-5233 Frazier K, Colvin E, Pouria S, et al. Microcystin toxicosis in cattle due to overgrowth of blue-green algeaJ. Vet humanToxico, 1998, 40(1): 23-244Mez K, Beattie KA, Hendriks JGA, et al. Identification of a microcystin