植物染色体毒理实验 蚕豆根尖微核实验.doc

蚕豆根尖微核实验摘要：本实验用洗发水诱导蚕豆根尖发生畸变，通过固定、酸解、，染色、压片、镜检等一系列过程观察蚕豆根尖细胞核及微核，通过微核的数量判断洗发水对人体毒害作用的大小。由于产生的微核数量与外界诱变因子的强弱成正比，因此可用微核实验来评价各种诱变因子对生物遗传物质的影响程度。 关键词： 蚕豆根尖 微核 卡诺固定液 吉姆萨染液前言：随着相关研究人员的一系列实验表明：日常用品中的一些物质会对植物细胞尤其是分生组织细胞产生明显影响，它们会破坏细胞中的遗传物质染色体，导致微核的产生，破坏细胞正常的生命活动。微核（micronucleus,简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下，着色与主核一致或稍浅，呈圆形或椭圆形。蚕豆根尖细胞的微核是由于根尖细胞在分裂时受到外界诱变因子作用，形成的不随细胞分裂进入细胞核的染色体片段。以观察细胞中微核的形成来检测遗传毒物，称为微核实验。利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可准确的显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的监测。目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。1材料1.1实验材料：蚕豆（根尖细胞的染色体大，DNA含量高，对诱变因子反应敏感）1.2 实验药品：1mol/L盐酸、固定液（乙醇、冰醋酸3：1配制）、吉姆萨染液1.3 实验用具：显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、盆、纱布、烧杯、水浴锅等2步骤2.1 浸种催芽将试验所用适量蚕豆放入盛水烧杯盆中，在室温下浸泡1d。种子吸胀后，用温润纱布松散包裹蚕豆置盆中，保持温度催芽2d，此时根长出将近约1.5cm。2.2 毒性处理选取根生长良好，根长一致的种子，分成两组，一组放入盛有被测洗发水的盆中，被测液浸没根尖即可。另一组放入盛有自来水的盆中培养，做对照组。两组均处理1d。2.3恢复培养 处理后的种子用自来水浸洗，洗净后再置入盛有自来水的盆中，恢复培养1d。2.4 固定将恢复后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根，用卡诺固定液固定5-6h。2.5 酸解 用蒸馏水浸洗干净固定好的幼根，吸净蒸馏水，加入1mol/L盐酸将幼根浸没，60酸解15分钟，幼根软化即可。2.6 染色用蒸馏水浸洗干净幼根，放入吉姆萨染液中，染色20-30min。 2.7 压片观察从幼根上截下1-2mm左右长的根尖，盖上盖玻片，压片镜检。3结果实验观察到的染色体图：首先在显微镜低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察。微核大小在主核1/3以下，并与主核分离，着色与主核一致或稍浅，呈圆形或椭圆形。每一处理观察3个根尖，每个根尖数1000个细胞，统计其中含微核的细胞数，然后平均，即为微核千分率，以此可作一个检测指标。实验组中，将近1000个细胞中，每个人（共八人）三次的平均数据是：6，4，8，10，10，13，24，17。对照组中，制作了五个玻片，微核数分别为：0，0，0，0，1。实验组微核千分率=具有微核的细胞数/观察统计的细胞数 6+4+8+10+10+13+24+17 =11.5 81000对照组微核千分率=具有微核的细胞数/观察统计的细胞数 0+0+0+0+1 =0.2 51000污染指数（PI）=样品实测微核率平均值/对照组微核率平均值=11.5/0.2=57.5（污染指数在01.5区间基本没有污染，1.52区间为轻度污染，23.5区间为中度污染，3.5以上为重度污染。）4分析讨论通过对照组与实验组对比，对照组（自来水）培养出的根尖细胞几乎没有微核，实验组（洗发水）培养出的根尖细胞中发现微核并且重度污染，由此说明市场出售的丝蕴洗发水对细胞有严重破坏作用，因此人类在使用时应尽量避免。此次实验中，做毒性处理时加入的洗发水剂量无法确定，所以实验观察到数量较多的微核有可能是由于诱变剂加多了。实验中，我们要注意以下几点：（1）选择种子做毒性处理时要挑选发芽时间相同，芽长相近的种子。（2）注意毒性处理时被测液的浓度，不能过高或过低。（3）解离时间要适中，否则解离不充分会影响观察结果。（4）要去根尖前端1-2mm左右长的根尖，适合观察。（5）视野的选择最好选择细胞边缘清晰，不重叠的，并要避免同一视野重复计数，应随机选择。（6）实验过程中，小组同学应互相配合，认真做好每一步，尤其是最后艰辛的计数工作，一定要耐心。5结论经过此次实验我学会了运用微核实验检测不同诱变剂毒害作用的方法，也意识到了自己在理论知识及实验操作方面的一些不足，今后我一定在认真学习专业知识并努力锻炼自己的动手操作能力。在此，向教会我理论知识并给予我实验技术指导的郝雪峰老师表示衷心的谢意，同时感谢太原师范学院细胞实验室为我提供实验地点和各种材料、用具、仪器、药品。谢谢！参考文献：1 梁光萍，罗向东，陈渝，等.真菌代谢提取物对蚕豆根尖细胞微核的诱导效应Q.第四军医大学学报，2003,24（13）:1221-1223.2 南晓光.蚕豆根尖细胞微核试验内蒙古民族大学学