环境中诱变物质的微核检测 山东大学.doc

山东大学实验报告 2014年 5 月9日科目 遗传学实验 题目 环境中诱变物质的微核检测 环境中诱变物质的微核检测摘要 微核是间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构，是真核生物细胞核染色体发生畸变在间期细胞中的另一种表现形式。本实验用大蒜根尖作为实验材料，分别以清水和叠氮化钠溶液作为阴性对照和阳性对照，用咖啡对实验组根尖进行诱变。经改良苯酚品红染色、制片后观察统计各组的千分微核率，从而对咖啡的诱变作用进行分析。1. 引言微核是间期细胞中在细胞核之外存在的一个或多个圆形或杏仁状结构，大小在主核的1/3以下，是有丝分裂后期丧失着丝粒的落后的染色体片段形成。微核是染色体畸变的一种表现方式。许多能引起染色体断裂的理化因素，如辐射、化学诱变剂等，均可作用于分裂细胞而产生微核。具体可分为：物理因素：具有能量的各种射线，如射线，射线，射线，X-ray，中子，质子，UV等。化学因素：诱变剂和重金属等。经典断裂剂：射线。诱变剂：环磷酰胺、氧化铬CrO3、叠氮化钠NaN3、甲基璜酸乙酯EMS、硫酸二乙酯。目前研究表明，微核发生率同作用因子的剂量呈正相关，通过简单的微核技术可以反映诱变物质对生物的遗传危害。因此微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。咖啡的主要成分为咖啡因。1980年美国食品药品管理局借动物实验观察表明, 咖啡因可以通过胎盘屏障, 引起胚胎畸形1。同时，据英国独立报报道, 世界卫生组织和联合国粮农组织最新的一项研究结果发现, 饮用咖啡的人平均每天摄入的致癌物质丙烯酞胺, 有三分之一来自烘烤的咖啡豆产生。人体大量摄入丙烯酞胺不但会影晌生殖系统功能, 还可致癌2。为了研究咖啡是否真正具有诱变致癌作用，本次实验通过用咖啡进行大蒜诱变培养，在阴性和阳性对照设计下，计算其微核率，通过微核检测技术评价咖啡的诱变情况。2. 材料和方法2.1 实验材料材料：大蒜培养皿、单面刀片、双面刀片、Eppendorf管、油性记号笔、显微镜、载玻片、盖玻片、镊子； 冰醋酸、无水乙醇、1M HCl溶液、100mmol/L NaN3溶液、雀巢速溶咖啡粉末，染液：改良苯酚品红。2.2 实验方法2.2.1 取材选取生长良好、大小相对一致的大蒜，剥成一瓣瓣后置于放清水的培养皿中。在20左右的室温下浸泡约48h。选取根长约0.5-1cm的大蒜作为实验处理材料。2.2.2 材料处理将实验材料分为六组，放入8ml不同成分的培养液中，其中1组为阴性对照组，培养液为清水；24组为阳性对照组，培养液分别为25mmol/L、50mmol/L、75mmol/L NaN3溶液；5、6组培养液分别为2倍正常浓度的咖啡（0.52g/ml）和正常浓度的咖啡（0.26 g/ml）。将培养皿中置于20摄氏度左右室温下培养24h。阴性对照组阳性对照组实验组1组2组3组4组5组6组清水25mmol/L NaN350mmol/L NaN375mmol/L NaN30.52g/ml咖啡0.26g/ml咖啡处理过后换用清水恢复培养24h，再将根尖切下，放在Eppendorf管中用卡诺氏固定液固定18h（少于24h）。最后转移到70%乙醇中放置在4保存。（卡诺氏固定液的配制： 3乙醇1冰醋酸）2.2.3 解离及染色用1M HCl处理大蒜根尖材料10Min,使其组织解离开。再用水洗3次，洗去根尖表面的解离液。切取近根尖分生区的伸长区组织，（根尖较白的区域及其上方约0.5cm左右）用改良苯酚品红溶液染色10Min。2.2.4 压片将染色后的材料盖上盖玻片，用一个双面刀片插到盖玻片和载玻片之间的一个小角，盖上两层吸水纸，用左手食指紧压盖玻片防止其滑动，用右手用解剖针针柄轻敲盖玻片，使材料均匀分散。在显微镜下观察细胞分散的便于观察时，用拇指垂直按压一下盖玻片。2.2.5 镜检先在低倍镜中找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察，找到微核。每个玻片选取一个或多个视野计数，统计含微核的细胞数和总细胞数，换算成微核千分率，然后取平均值。3. 结果实验结果图 图1 含微核的细胞（10X40） 图2含微核的细胞（10X40） 图3 1组（10X40） 图4 2组（10X40） 图5 3组（10X40） 图6 4组（10X40 图7 5组（10X40） 图8 6组（10X40）3.2 实验结果分析与统计图1、2中可以看到不同种类的含有微核的细胞，这些细胞都有以下特征：（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。（2）小核着色与主核相当或稍浅。（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。图3-8分别为1-6组的其中一个视野结果图。其中，3组的视野由于敲片力度过大导致细胞破裂，整个背景都成了紫红色，难以观察计数。数据分析如下：组别阴性对照组阳性对照组实验组1组2组3组4组5组6组培养液清水25mmol/L NaN350mmol/L NaN375mmol/L NaN30.52g/ml咖啡0.26g/ml咖啡含微核细胞数（个）00145无法计算1078细胞总数（个）30215198159无法计算200197257微核千分率（）051.08无法计算50.0035.5331.13根据数据我们发现，咖啡存在一定的致癌率，但致癌作用要弱于NaN3。随着咖啡浓度的升高，微核率也相应增多。由于实验设计存在一些问题，根尖的数量相对较少，实验组的浓度梯度设计的不够多，所以仅根据本次实验无法得出微核率最大的咖啡浓度和微核率最大的咖啡处理时间，只能进行定性分析。4. 讨论4.1改进之处：1.由于培养大蒜的时候，放的大蒜不够多，导致长出根的大蒜相对较少，根的数量有限，难以进行多组实验。阳性对照组为出现正相关，可能是因为实验材料过少，数据采集过少导致有偏差。2.敲片的力度一定要掌握好，不能过重，也不能过轻。力度过大会导致细胞破裂，无法观察和计数含有微核的细胞（如3组结果）。3. NaN3见光会分解，所以在用溶液处理材料时，不要把培养皿放置在窗台，最好放置在恒温箱中，以免对实验产生误差。本组在实验过程中没有注意到这一点，因此对于2-4组结果存在怀疑。4.阳性对照组作为实验组的对照应该少设几组，多做几组不同梯度的实验组，才能更好的得出结论。5.后续实验中，可以在本次实验的基础上，再设置不同浓度梯度的咖啡实验组，并且分别处理不同的时间，来观察相应的结果，进行定量分析。4.2 扩展知识1. 改良苯酚品红染液配法顺序如下：原液A：取3克碱性品红溶于100毫升70%酒精中，此液可以长期保存。原液B：取A液10毫升加入90毫升5%苯酚(即石炭酸)水溶液中(2周内使用)。原液C：取B液55毫升加入6毫升的冰醋酸和6毫升38%的甲醛(可长期保存)。染色液：取C液10-20毫升，加入90-80毫升45%醋酸和1.5克山梨醇。放置2周后使用，染色效果显著，可普遍用于植物组织的压片法和涂片法，使用2-3年不变质。改良苯酚品红溶液不能用乙醇洗脱色，所以染色过深时不能用乙醇脱色。2. 咖啡的成分大约有300余种, 主要成分是咖啡因。咖啡因是一种生物碱, 是嘌呤的衍生物, 具有温和的中枢神经系统兴奋作用, 属最广泛应用的药物之一。查阅资料发现3，咖啡对生殖有影响，具有胚胎毒性；咖啡因也具有致突变性；咖啡与乳腺癌、胰腺癌等癌症都具有明显相关性。参考文献1 王民明, 姚玉龙, 赵慧秋, 等. 咖