[理学]6 第六章核酸.ppt

第六章核酸 生物化学nucleicacid 核酸的生物学意义 核酸是一切生物机体不可缺少的组分 是生命遗传信息的携带者和传递者 它不仅对于生命的延续 生物物种遗传特性的保持 生长发育 细胞分化等起着重要的作用 而且与生物变异 如肿瘤 遗传病 代谢病等也密切相关 是现代生物化学 分子生物学和医学的重要基础之一 生物化学nucleicacid 核酸与遗传 的发现 1868年 F Miescher从细胞核中分离得到一种酸性物质核素 即现在被称为核酸的物质 1939年 E Knapp等第一次用实验方法证实核酸是生命遗传的基础物质 1953年 Crick Watson双螺旋模型的提出 奠定分子遗传学和分子生物学的基础 具有十分重大的意义 1958年 Crick总结提出中心法则 centraldogma 2004年 Crick逝世 生物化学nucleicacid 核酸与遗传 的研究进展 1970 s DNArecombinanttechnology DNA切割技术 分子克隆 快速测序 标志着生物技术的兴起 1972年 P Berg交将外源DNA片段插入猴病毒SV40的环状DNA分子 获得第一个DNA体外重组体 但未克隆 1973年 S Cohen得到细菌重组体 1975年 F SangerDNA酶法测序1976年 A M Maxam W GilbertDNA化学测序法1986年 H Dulbecco提出HGP 1990开始实施 进入post genomeera1994年 M Williams 提出proteomics 生物化学nucleicacid Emphais 核酸的生物学功能 RNA 核酸的结构 secondstructure 核酸的理化性质 UV denature 核酸的测序 PCR 生物化学nucleicacid Content 核酸的类型和组成核酸的结构核酸的性质核酸的合成核酸一级结构测定 生物化学nucleicacid 1 核酸的类型和组成 核酸分类 脱氧核糖核酸 DNA DeoxyribonucleicAcid核糖核酸 RNA RibonucleicAcid 生物化学nucleicacid 核酸功能DNA 含有所有生物的遗传信息 是主要的遗传物质RNA mRNA tRNA rRNA负控制蛋白质的合成 负责翻译作用于RNA的转录后加工和修饰基因表达与细胞功能的调节生物催化和其它细胞持家功能遗传信息的加工与进化逆转录 生物化学nucleicacid 核酸 DNA和RNA 是一种线性多聚核苷酸 它的基本结构单元是核苷酸 核苷酸本身由核苷和磷酸组成 而核苷则由戊糖和碱基形成DNA与RNA结构相似 但在组成成份上略有不同 1 核酸的组成 生物化学nucleicacid 二者的区别 生物化学nucleicacid 附1 saccharide 生物化学nucleicacid 附2 base 腺嘌呤Adenine 鸟嘌呤guanine 尿嘧啶uracil 胞嘧啶cytosine 胸腺嘧啶thymine 生物化学nucleicacid 2 nucleoside 糖与碱基之间的C N键 称为C N糖苷键 生物化学nucleicacid 3 nucleotide B 腺嘌呤 鸟嘌呤 胞嘧啶 尿嘧啶或胸腺密啶核酸中也存在一些不常见的稀有碱基 稀有碱基的种类很多 大部分是上述碱基的甲基化产物 生物化学nucleicacid 4 Polynucleotide 多聚核苷酸是通过核苷酸的C5 磷酸基与另一分子核苷酸的C3 OH形成磷酸二酯键相连而成的链状聚合物 方向 5 3 为正方向 表示方法 5 PAPCPGPCPTPGPTPA3 或5 ACGCTGTA 3 生物化学nucleicacid MessengerRNA 约占总RNA的5 不同细胞的mRNA的链长和分子量差异很大 寿命短暂它的功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白质合成基地 核糖核蛋白体 真 原核生物的不同 原核生物为多顺反子 生物化学nucleicacid TransferRNA 约占总RNA的10 15 它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信息 并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体的作用 已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA RNA分子的大小很相似 链长一般在73 78个核苷酸之间 生物化学nucleicacid 约占全部RNA的80 是核糖核蛋白体的主要组成部分 rRNA的功能与蛋白质生物合成相关 RibosomeRNA 生物化学nucleicacid 5 核苷酸的衍生物 ATP ATP是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物 是一种重要的能量中间体 生物化学nucleicacid 5 核苷酸的衍生物 GTP GTP主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体 是生物体内游离存在一种高能化合物 在许多情况下 ATP和GTP可以相互转换 生物化学nucleicacid 5 核苷酸的衍生物 cAMP cGMP cAMP 3 5 环腺嘌呤核苷单磷酸 和cGMP 3 5 环鸟嘌呤核苷单磷酸 的主要功能 作为细胞之间传递信息的信使 cAMP和cGMP的环状磷酯键是一个高能键 在pH7 4条件下 cAMP和cGMP的水解能约为43 9kJ mol 比ATP水解能高得多 生物化学nucleicacid 2 核酸的结构 按结构层次 一 二 三 核酸的碱基顺序是核酸的一级结构 DNA的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式 生物界物种的多样性即寓于DNA分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中 而mRNA的碱基顺序 则直接为蛋白质的氨基酸编码 并决定蛋白质的氨基酸顺序 生物化学nucleicacid 1 mRNA的一级结构 3 tail 真核细胞mRNA3 末端有一段长达20 250polyA 转录后加入 原核生物的mRNA一般无polyA 某些病毒mBNA有polyApolyA与mRNA从细胞核到细胞质的转移运输有关 与mRNA的半寿期有关 新mRNApolyA链较长 衰老链短 5 Cap 5 末端有1 2个G的核糖被甲基化分为O nometh I 1meth II 2meth 三种类型防止或抵抗5 核酸外切酶对mRNA的降解与蛋白质合成的起始作用有关 识别一核糖体 生物化学nucleicacid 附1 真核生物mRNA的一级结构 生物化学nucleicacid 附2 mRNA与DNA的区别 生物化学nucleicacid UTR UTR 2 tRNA的一级结构 分子量25000左右 大约由70 90个核苷酸组成 沉降系数为4S左右 分子中含有较多的修饰成分 3 末端都具有CpCpAOH的结构 5个区及功能 生物化学nucleicacid 附1 tRNA的二级结构 生物化学nucleicacid 在三叶草型二级结构的基础上 突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对 目前已知的tRNA的三级结构均为倒L型 附2 tRNA的三级结构 生物化学nucleicacid 3 rRNA的二级结构 局部螺旋 许多rRNA的功能迄今仍不十分清楚 生物化学nucleicacid 4 DNA的一级结构 生物化学nucleicacid 真 原核细胞的结构基因 结构模型的多样性 DNA二级结构的形式 B A C D Z H多种模型1953年 J Watson和F Crick在前人研究工作的基础上 根据DNA结晶的X 衍射图谱和分子模型 提出了著名的DNA双螺旋结构模型 并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测 DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果 双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式 5 DNA的二级结构 生物化学nucleicacid 螺旋之美 DNA分子由两条DNA单链沿同一根轴平行盘绕 形成右手双螺旋结构 螺旋中的两条链方向相反 即其中一条链的方向为5 3 而另一条链的方向为3 5 螺旋横截面的直径约为2nm 每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0 34nm 每10个核苷酸形成一个螺旋 其螺矩 即螺旋旋转一圈 高度为3 4nm嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧 磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧 碱基环平面与螺旋轴垂直 糖基环平面与碱基环平面成90 I B DNA双螺旋结构特点 生物化学nucleicacid 生物化学nucleicacid C三G A T 生物化学nucleicacid DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定维持这种稳定性的因素包括 两条DNA链之间形成的氢键 由于双螺旋结构内部形成的疏水区 消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响 介质中的阳离子 如 Na K 和Mg2 中和了磷酸基团的负电荷 降低了DNA链之间的排斥力 范德华引力等 改变介质条件和环境温度 将影响双螺旋的稳定性 II DNA双螺旋结构的稳定性 生物化学nucleicacid III DNA与蛋白质复合物结构 生物化学nucleicacid 6 DNA的三级结构 在二级结构的基础上产生三级结构 即双螺旋DNA通过扭曲和折叠所形成的特定构象 包括 不同二级结构单元间的相互作用单链与二级结构单元间的相互作用DNA的拓扑结构 超螺旋三级结构对DNA性质的影响电泳速率不同 cccDNA ocDNA linearDNA 生物化学nucleicacid 3 核酸的性质 核酸的互变异构酸碱性质核酸的理化性质 生物化学nucleicacid 1 核酸的互变异构 碱基的芳香环与环外基团可以发生酮式 烯醇式或胺式 亚胺式互变异构 DNA变异的自然动力 生物化学nucleicacid 2 核酸的酸碱性质 嘌呤碱基和嘧啶碱基都具有弱碱性 环内氨基的pKa值约为9 5 环外的氨基 存在于A G和C 的碱性很弱 在生理pH条件下不能被质子化 因此嘌呤和嘧啶碱基碱性主要是环内氨基的贡献 碱基都具有芳香环的结构特征 嘌呤环和嘧啶环均呈平面或接近于平面的结构 生物化学nucleicacid 3 核酸的理化性质 I 物理性质溶解性 易溶碱或水 不溶有机溶剂离心沉降的性质 超离心法 氯化铯梯度离心场中 上 下 PN lineDNA circleDNA plasmidDNA电泳 泳动方向 紫外吸收 生物化学nucleicacid 附 核酸的紫外吸收 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系 一般在260nm左右有最大吸收峰具有增色效应和减色效应可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据 如 DNAA260 A280DNA 1 8 RNA为2 0 生物化学nucleicacid 不同核苷酸衍生物的UV 生物化学nucleicacid II 化学性质 烷基化反应 在一定条件下 碱基环上氮原子可以发生烷基化反应在同样条件下 U和T基本上不起反应 应用CH2N2作为烷基化剂 则所有碱基都能发生上述反应 生物化学nucleicacid 为什么能够两性电离 与蛋白质相似 核酸分子中的酸性基团 磷酸基 碱性基团 氨基 等电点 分子中的磷酸是一个中等强度的酸 而碱性 氨基 是一个弱碱 核酸的等电点比较低 如 DNA的等电点为4 4 5 RNA的等电点为2 2 5RNA的等电点比DNA低的原因 RNA分子中核糖基2 OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离 而DNA没有这种作用 III 化学性质 两性电离及等电点 生物化学nucleicacid IV 化学性质 水解 酸或碱水解 核酸分子中的磷酸二酯键可在酸 碱性条件下水解切断 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别 如 在0 1mol LNaOH中 RNA几乎可以完全水解 生成2 或3 磷酸核苷 DNA则不受影响 原因 这种水解性能上的差别 与RNA2 OH的邻基参与作用有很大的关系 在RNA水解时 2 OH首先进攻磷酸基 在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯 再在碱的作用形成水解产物 生物化学nucleicacid 生物体内存在多种核酸水解酶 可催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键 DNases和RNases根据作用方式分作两类 核酸外切酶和核酸内切酶endonucleuase 在分子生物学研究中最有应用价值 可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位 酶水解 生物化学nucleicacid V 核酸的变性 复性与杂交 denature核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂 变成单链结构的过程 核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂 所以它的一级结构 碱基顺序 保持不变 变性核酸将失去其部分或全部的生物活性 引起核酸变性的因素 温度升高 酸碱度改变 甲醛和尿素等 生物化学nucleicacid denaturation 生物化学nucleicacid 附 DNA变性的特性 1 突变性 变性过程在很窄温度区间内Tm完成 Tm值预测 一般DNATm在70 85 C之间 与分子中G C含量有关 可反映DNA分子中GC含量 经验计算公式 G C Tm 69 3 2 44结构变化 当DNA的稀盐溶液加热到80 100 时 双螺旋结构即发生解体 两条链彼此分开形成无规线团 性质变化 DNA变性后一系列性质随之发生变化 如紫外吸收 260nm 值升高 粘度降低等 生物化学nucleicacid 附 DNA变性的特性 2 检测 紫外吸收的增色效应 影响因素 DNA自身的 G C 离子类型 强度 浓度RNA变性行为所引起的性质变化没有DNA明显 生物化学nucleicacid ChangeofAdsorptionindenaturation 生物化学nucleicacid EffectsofDNAchain pairand G C onthedenaturation 生物化学nucleicacid Renaturation 变性DNA在适当的条件下 两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构的过程 DNA复性后 一系列性质将得到恢复 但是生物活性一般只能得到部分的恢复 DNA复性的程度 速率与复性过程的条件有关 将热变性的DNA骤然冷却至低温时 DNA不可能复性 但是将变性的DNA缓慢冷却时 可以复性 DNA的复性也与它本身的组成和结构有关 分子量 DNA浓度 G C 生物化学nucleicac