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动物细胞工程教学课件 甘肃农业大学生命科学技术学院 主讲杨志杰 第三部分动物胚胎工程 第二章动物体外受精技术Invitrofertilization 1概述 一 概念是指精子和卵子在体外模拟体内的生殖道环境中完成受精过程的技术 它的基本原理是在人工模拟体内环境 包括营养 温度 湿度 气体 渗透压 pH等 使卵丘卵母细胞复合体中的初级卵母细胞成熟 同时使精子获能 完成受精 1978年7月25日世界首例试管婴儿 1988年3月10日我国首例试管婴儿 1992年我国首例三胞胎试管婴儿 由于卵子和精子的受精过程是在实验室中完成 故通过这一技术而产下的动物又称为 试管动物 如 试管牛 试管猪 试管婴儿 等 该技术包括以下几个技术环节 卵母细胞体外成熟培养 IVM 体外受精 IVF 和受精卵体外早期培养 IVC 试管动物技术 体外受精 卵子精子体外受精卵早期胚胎移植产生后代 不同动物胚胎移植时间不同 桑椹胚阶段 牛 羊 8个或16细胞胚阶段 小鼠 家兔 4个细胞胚阶段 试管婴儿 1951年 美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象 这一领域的研究才获得突破性进展 1959年 张明觉以家兔为实验材料 从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子 即体内获能的精子 从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子 精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程 并产下15只健康仔兔 这是世界上首批试管动物 它们的正常发育标志着体外受精技术的建立 二 发展历史 目前 采用IVF ET技术 每对废弃的牛卵巢可获得3头左右的犊牛 为充分利用良种母牛的遗传资源 20世纪80年代后期 牛的活体取卵技术 OvumpickUP OPU 发展迅速 活体取卵和IVF ET结合已成为欧 美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群选择的重要繁殖技术 牛的体外受精技术不仅应用于畜牧生产 同时 也成为研究其他胚胎生物技术 如克隆 转基因 胚胎干细胞分离培养和性别控制等的重要辅助手段 体外受精技术的发展简史 研究现状 三 存在的问题和发展方向 1 存在的问题 囊胚发育率低 细胞数少 产仔率低 胎儿初生重高 2 发展的方向 深入研究卵母细胞成熟和胚胎发育的分子机理 加强腔前卵泡的培养研究 充分利用优良母畜的遗传资源 加强体外受精与其他生物技术的结合 四 意义 1 研究哺乳动物配子发生 受精和胚胎早期发育机理 2 在家畜品种改良中 体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段 对充分利用优良品种资源 缩短家畜繁殖周期 加快品种改良速度等有重要价值 3 在人类 IVF技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一 4 体外受精技术还是哺乳动物胚胎移植 克隆 转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分 国产奶牛 年均产奶量3000公斤左右国际良种奶牛 年均产奶量10000公斤左右引进一头良种成年奶牛需要3万 5万元 牛的生育率低 一头牛一胎只生一只 一生只能生育四五次 牛的生育率虽然很低 但是牛的卵母细胞却相当的多 其卵巢中卵母细胞数目要比一生中排卵数多1000倍左右 公牛产生的精子数目就更多了 从试管牛说起 胚胎移植 采集良种母牛的卵母细胞 卵母细胞的体外培养 采集良种公牛精子 精子体外获能 体外受精 良种牛体外受精胚胎 受体牛 良种犊牛 成熟期牛 屠宰加工厂 市场 采集卵巢中的卵母细胞 试管牛 工厂化生产的技术流程图 2卵母细胞的体外成熟 一 卵母细胞的获取在卵母细胞获取技术中 卵泡发育的募集 选择和优势化 是人工超数排卵和卵母细胞体外成熟的重要基础 卵巢中含有大量的小卵泡 但在每个发情周期中只有部分卵泡能够接受FSH LH的作用开始发育 这一现象称为募集 由于促性腺激素的作用 使卵泡细胞雌激素的合成和分泌增加 雌激素通过负反馈作用于下丘脑 控制脑垂体减少FSH的分泌 使其他小卵泡无法接受促性腺激素的作用 结果使卵泡发育闭锁 这一现象称为选择 卵泡发育到最后阶段 只有少数几个或一个优势卵泡继续发育 这一现象称为优势化 由于雌激素的负反馈作用 促卵泡素水平继续下降 而促黄体素分泌增高 在发情周期的中期促黄体素量达到峰值而激发排卵 卵泡排出卵子后 将发育成黄体 分泌孕酮和少量雌激素 这些激素反馈作用于下丘脑 抑制脑垂体分泌促卵泡素和促黄体素 从而抑制卵泡的发育 卵母细胞体外成熟培养时 在培养液中加入促卵泡素活PMSG hCG 能显著提高卵母细胞体外成熟率 1 离体卵巢采卵 是从屠宰母畜的卵巢采集卵母细胞 1 卵泡抽吸法 用注射器针头从卵泡远端抽吸卵泡液 2 卵巢解剖法 切割法 剥离法 用手术刀或剪划破卵巢 再悬浮 消化获取卵母细胞 对卵泡卵母细胞一般采用机械分离法和酶消化法相结合 既克服了机械分离时间长和对卵母细胞机械损伤的缺点 又减轻了酶消化过程中对细胞细微结构的破坏 刚采集羊卵母细胞 刚采集牛卵母细胞 培养成熟牛卵母细胞 2 活体采卵 是从活母畜的卵巢采集卵母细胞 B超引导法 借助超声波 B超 探头和屏幕的引导 从活母畜卵巢采集卵母细胞 即利用真空泵的负压将卵母细胞及卵泡液吸入离心管 保定母畜 全身麻醉 清除直肠粪便 消毒肛门及外阴 操作员先将带有B超探头和采卵针的采卵器通过阴道插入子宫 同时通过将卵巢贴在探头上 根据B超屏幕所显示的卵泡位置 利用采卵针穿刺卵泡并同时抽吸卵母细胞 科研人员利用注射器将一只1个半月大母羊卵巢中的卵母细胞抽吸出来进行体外培养 4月30日摄 新华社记者张鸿墀摄 镜下检卵 B 超活采仪 B超活体采卵 活体采集的牛卵母细胞 借助超声波探头和屏幕的引导 从活母畜卵巢采集卵母细胞 操作员先将带有超声波探头和采卵针的采卵器通过阴道插入子宫 同时通过将卵巢贴在探头上 根据B超屏幕所显示的卵泡位置 利用采卵针穿刺卵泡并同时抽吸卵母细胞 B超引导法 卵母细胞的分级及筛选 A级 卵母细胞周围有3层以上致密卵丘细胞 胞质均匀并充满于透明带内 B级 卵母细胞外周有1 3层卵丘细胞 胞质均匀 C级 卵母细胞的卵丘细胞扩散 胞质不均匀 D级 卵母细胞是无卵丘细胞的裸卵 胞质不均匀 有暗斑 其中 A级 B级卵母细胞是可用的 C级 D级卵母细胞已经老化 不可用 裸卵 二 卵母细胞的体外成熟 IVC 1 卵母细胞的成熟过程哺乳动物卵母细胞依其生长发育阶段可分为生长期和成熟期 人工采集的卵母细胞大都完成了生长 进入成熟期 卵母细胞处于第二次成熟分裂间期而达到中期 M 在光镜下可看到生发泡破裂和第一极体排出 电镜下 线粒体由近核区移向质膜下区 在一端出现大空泡 即帽状线粒体 这是卵母细胞成熟的一个重要标志 2 卵母细胞体外成熟培养现状 未成熟卵母细胞的体外成熟培养及体外受精在小鼠研究比较深入 在家畜也取得较大进展 牛 猪等有体外受精仔畜产生 但在牛等大家畜卵母细胞IVM IVF系统存在两个问题 一是IVM IVF的胚胎发育率较低 二是IVM IVF培养系统中血清和体细胞的加入使培养液成分复杂化 很难从中分析出影响IVM IVF的关键因素 在猪存在的问题是 多精入卵率高 体外受精卵发育率低 3 卵母细胞体外成熟的培养体系 1 培养液 用于卵母细胞体外成熟的最为广泛基础培养液是M199 培养时尚要加入一定的血清和激素 2 温度和气相 牛 猪 羊和马等家畜的卵母细胞体外成熟培养的温度一般为38 39 所有哺乳动物卵母细胞体外成熟培养的气相一般要求在含5 C02的空气和饱和湿度的环境或5 C02 90 N2 5 O2和饱和湿度 3 培养时间 牛和羊卵母细胞体外成熟培养的时间一般为22 24h 而马为30 36h 猪为40 44h 4 培养方法 卵母细胞体外成熟的培养方法一般采用微滴法 封闭法和开放法三种 4 卵母细胞体外成熟的标志及特征 1 生发泡破裂 2 染色体凝集 3 纺锤体形成 4 第一极体排出 5 透明带软化 6 卵丘细胞扩展 5 影响卵母细胞体外成熟的因素 动物种类 卵母细胞的类型 卵母细胞和卵泡的大小 1 5 2mm 卵巢运输和季节 6h 30 繁殖季节 2 培养环境 温度 时间 气相 培养基 3 生化因子 Ca2 甾类激素 LH可诱导卵母细胞成熟 而雄激素和PG则可抑制卵母细胞成熟 卵母细胞成熟抑制因子 1 卵母细胞的来源 6 几种动物卵母细胞体外成熟培养的方法 1 小鼠A 培养液 9 4mlTYH液 0 5mlFBS 100IUPMSG或者T6液 4mg mlBSA 于当天上午对小鼠皮下注射5IUPMSG 促进卵泡发育 注射PMSG46h后颈椎脱臼法处死小鼠 立即摘出卵巢 在表面皿中1 0 1 5ml的TYH HEPES液 在体视显微镜下刺破卵泡 选择充分发育的卵母细胞 在石蜡液滴 50 100ul 10 20个卵母细胞 中培养 B 方法 2 牛 羊A 培养液 TCM199 25mmol LHEPES 7 5 FBS 0 5mg L羊FSH 5 0mg L羊LH E2 双抗或者TCM199 0 2mmol L丙酮酸钠 50mg L庆大霉素 0 5mg L羊FSH 5 0mg L羊LH 1 0mg LE2 0 3 PVPB 方法 从屠宰场获取牛卵巢后 放入25 30 DPBS或生理盐水中加双抗的保温瓶中立即带回实验室 从卵巢表面吸取2 8mmCOC 放入石蜡液滴中培养 22 26h C02培养箱 三 精子获能 1 概念精子在通过附睾时已经获得了受精能力 但由附睾分泌的一种物质覆盖在顶体表面 抑制了其受精能力 这种物质叫做去能因子 精子在雌性生殖道或体外培养液中停留一段时间后 去能因子的作用被解除 精子在生理上和形态上发生一系列变化并获得受精 穿透卵子 能力的生物学现象 叫之 能够解除去能因子的物质称为获能因子 2 精子获能的途径 目前 精子体外获能的途径主要有高离子强度处理法 高PH处理法 钙离子载体处理法 肝素处理法 咖啡因处理法以及添加牛卵泡液 子宫液和输卵管液等 哺乳动物精子获能的模型 1 高离子强度处理法 Oliphant和Brackett 1973 首先用高离子强度液使小鼠精子体外获能 随后 他们 1975 在特定培养液 Brackett Oliphant BO液 或称限定培养液 definedmedia DM 液中加入3 4mgNaCL mL 从而使NaCL浓度高达170mmol L 渗透压为380mOsm 以此HIS处理家免精子15min体外受精后获得了试管兔 以相同的方法处理牛精子 与成熟卵泡卵母细胞体外受精后移植 获得了试管牛 Brackettt等 1982 HIS液可以置换精子表面抗原物质或去能因子 从而诱发顶体反应 精子的顶体反应是一个钙离子依赖过程 IA A23187 与钙离子形成复合物 携带钙离子进入精子内 可诱发顶体反应并激活顶体酶 如果在处理中添加咖啡因 则获能效果更好 但IA对精子作用很强烈 处理时间过长或浓度过高都会导致精子急剧死亡 对不同动物的精子在IA浓度 处理时间和咖啡因浓度方而进行了详细研究 确定了最优化获能条件 2 钙离子载体 GAGs可促进精子对钙离子的吸收 诱发顶体反应 不同类型的GAGs对精子获能的作用程度不同 这种获能作用有赖于氨基多糖的硫酸化程度 肝素是硫酸化程度最高的GAGs 其诱导精子获能的作用最强 肝素浓度以10 20ug mL为宜 处理时间为5 60min 如再加入咖啡因 还可提高获能效果 此外 几乎在各种动物的精子获能中均以BSA作为辅助成分 BSA可以改变 除去 精子膜上的胆固醇含量 降低精子膜上胆固醇 磷脂比率 改变精子膜的稳定性 发生顶体反应 BSA还对精子活力和超活化运动有维持作用 精子一旦获能 BSA可促进其迅速穿透卵子 3 氨基多糖法 受精液 通常使用Tyrode s改良液和BO液受精方法 微滴法 四孔培养板法精卵共培养的时间 温度和气相 受精后 卵母细胞应立即放入温度39 含5 CO2的空气和最大相对湿度的CO2培养箱中培养24 44h 其中牛22 24h 将假定的受精卵从受精液中取出 再在早期胚胎体外培养液中继续培养18 33h 受精后40 44h检查受精卵的分裂率 3 精子获能的一般方法 精子获能可分为两个阶段 第一个阶段是脱去精子表面的抗原物质和去能因子 增强膜的通透性 是一定程度上的生理学变化 第二阶段是精子细胞膜蛋白变化 即发生顶体反应 是不可逆的结构上的获能 精子获能有两种方法 即体内获能和体外获能 体外获能一般分为两步 首先是精子的洗涤 经一次或多次离心后除去杂质 精清 死精子 低活力的精子 冷冻保护液及稀释液等 牛精子洗涤液一般采用BO液和改良的Tyrode s液 TALP 山羊多用mDM液和不含BSA的BO液 猪多用TCM199液 其次是精子的获能处理 用高离子强度液 钙离子载体 肝素和BSA等 以促使Ca2 进入精子载体 使精子细胞质中PH升高 诱发精子获能 几种动物精子获能的方法 1 小鼠 1 培养液为T6 2 方法 从附睾或输精管收集精子于1mlT6 10ml mlBSA中 在37 5 CO2培养箱中孵育1 5h 取上部精子悬液用于体外受精 2 牛 1 培养液为无钙台式液 2 方法 从冷冻容器取得牛冻精管 在35 37水浴中解冻30 40s 消毒 每管精液吹入加有1ml获能液的试管中 获能液在培养箱中过夜 试管在培养箱中45度角放置1h 吸取上层悬浮液到灭菌的离心管 离心 洗涤 取50 80ul的悬浮液 用等量获能液稀释 培养箱中悬浮15min 使精子密度为5 0 107个 ml 用注射器针头吹吸悬浮液 以吹散精子 4 获能后精子的生理变化 1 代谢变化精子活力增强 耗氧量增多 2 精子内部离子浓度的变化精子膜内K CL 和Ca2 浓度升高 3 顶体和核的变化顶体内容物由不活跃状态变为活跃状态 精子核蛋白稳定性减弱 4 膜成分的变化5 运动形式的变化 4 获能精子的检测 1 运动方式的测定吸取5uL获能的浮游精子 滴到载玻片上 盖上盖玻片 周围滴液体石蜡防干固 置暗视野显微镜下观察精子活力 运动类型和运动速度 判断体外获能效率 2 顶体反应的检测伴随着精子获能 可以诱发顶体反应 这是精子入卵不可缺少的变化 观察顶体反应是判断精子获能的有效方法之一 顶体反应的观测方法有两种 顶体反应的检测 用电镜技术观察精子的超微结构 如果精子头部质膜与顶体外膜泡状化 或仅残存顶体内膜 就能准确地判断精子发生了顶体反应 电镜技术制片繁琐 成本高 一般实验室尚难实施 将精液用培养液或稀释液 以1200 1500g离心5min 洗涤3次 将精子悬浮与等量1 台盼蓝混合 在离心管中于38 培养10min 600g离心7min 弃上清液 然后将精子重新悬浮于稀释液中 反复洗涤两次 直到上清液清亮或呈谈蓝色为止 将精子滴于玻片上 涂片 风干 将用1mol L二甲胂酸盐缓冲液 pH7 4 配制的3 戊二醛溶液滴于玻片固定精子30min 然后用无离子水洗两次 以0 8 的碱性棕Y水溶液染色5min 水洗 再以用lmol LTris缓冲液 pH5 3 配制的0 8 盂加拉玫瑰红染色12min 水洗 用酒精系列脱水 二甲苯透明 中性树脂封片 以1500倍镜检 采用顶体三重染色技术 TST 光镜检测 TST可将精子顶体帽和顶体后区染成不同的颜色 当顶体后区呈蓝黑色时 说明该精子在染色前已经死亡 顶体后区呈棕色时 说明该精子在染色前是活精子 顶体帽呈品红色时 说明从未发生过顶体反应 顶体帽呈白色者 说明精子发生过顶体反应 TST法虽然可以准确地将真假顶体反应的精子区分开来 无需昂贵的设备 但不足之处是有可能将一部分固定染色前已死亡的真顶体反应精子误判为假顶体反应精子 一般检测只在试验精子获能方法时应用 一旦精子获能方法成熟 不需再进行这种检测 5 体外获能的意义 去除精子表面的覆盖物 暴露出精子膜表面与卵子相识别的位点 顶体反应 增加精子活力 改变膜的通透性 精子头部出现流动性不相等的区域 为精子膜与顶体膜融合做好准备 精子顶体后区膜的流动性加大 以准备与卵膜结合 四 体外受精 1 浮游程序一般是将洗涤后的精液加入适当的溶液中 在培养箱中静置30 60min 使活力高的精子浮游到最上层 以选取活力高 质量好的精子 当精液质量和精子活力较差时 必须进行浮游 2 玻璃棉过滤程序用TEST 蛋黄缓冲与玻璃棉过滤结合的方法 使活力高的精子穿透玻璃棉 得高活力高的精子 1 精子预处理 2 精子活力的提高 在IVF中 可以通过加入一些化学物质来刺激精子 使其活力提高 1 咖啡因通过抑制磷酸二酯酶而导致cAMP积累 可提高体外受精率 提高顶体反应 2 PHE是青霉胺 亚牛磺酸和肾上腺素的混合物 3 肝素肝素能引起钙离子进入精子细胞而导致精子获能 通常与咖啡因一起用于牛精子的体外获能和受精 但对猪精子获能具有抑制作用 4 2 氯腺苷 2 CL A 和2 脱氧腺苷 2 DXA 可刺激cAMP的产量而提高精子活力 5 血小板激活因子 PAF 与排卵时卵泡破裂有关 6 谷胱甘肽 GSH 7 钙离子载体能直接诱发钙离子进入精子细胞内部 提高细胞内的钙离子浓度 导致精子获能 8 BSA可除去精子质膜中的部分胆固醇 降低胆固醇在精子质膜中的比例 改变精子质膜的稳定性 导致精子获能 3 精卵相互作用 1 透明带反应精子进入卵子后 卵子的皮质颗粒和卵质膜发生融合 释放出蛋白酶和糖苷酶 溶解透明带上的zp3 改变了透明带的结构 从而阻止多余的精子和透明带结合 2 顶体反应 精子和卵丘细胞及透明带接触后 精子的顶体外膜和精子质膜发生点状融合 释放出顶体内容物的过程 顶体反应是受精的先决条件 顶体反应的机理在于精子接触到到卵丘细胞及透明带时 卵丘细胞或透明带上的zp3便和精子质膜上的受体结合 该受体是一种Ca2 运载蛋白 它的激活促进了Ca2 的内流 内流的Ca2 灭活Na K ATP酶 导致细胞内Na 浓度升高 H 外流 细胞内PH升高 Ca2 结合到质膜内面和顶体外膜的阴离子磷脂上 引起膜磷脂破裂 促进两膜融合 4 几种动物的体外受精 饲养 促发情 取卵 精子采取与获能 注射PMSG hCG 摘取卵巢 收集COC 取附睾尾 孵育精子 获能液为T6 TYH KRB 受精卵 微滴培养 37 5