武威西门塔尔牛MSTN.doc

甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因外显子遗传变异的研究孙雪婧1a,c,高雪晋1b,李积友2,杜晓华1a,c, 刘霞1b,c,杨孝朴1a收稿日期：基金项目：甘肃省草食畜牧业发展行动河西肉牛选育项目（2013）作者简介：孙雪婧(1987-)，女，山东青岛人，在读硕士研究生，主要从事生物化学与分子生物学的研究。Email：544879429 *通讯作者：杨孝朴（1962-），男，甘肃靖远县人，教授，硕士生导师，主要从事生物化学与分子生物学的研究。(1 甘肃农业大学 a 动物医学院 b生命科学技术学院c甘肃省草食动物生物技术重点实验室2甘肃省畜牧业产业管理局)摘 要：为分析肉牛MSTN基因的遗传多态性及变异特征。采用PCR-SSCP方法检测了60头甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因的多态性，对群体内各等位基因进行了克隆测序。结果显示，武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子存在A、B两个等位基因以及AA、AB两种基因型，基因型频率分别为0.9167、0.0833；第2外显子存在A、B两个等位基因以及AA、BB、AB三种基因型，基因型频率分别为0.5、0.25、0.25。序列分析表明，武威西门塔尔牛MSTN第1外显子在269bp发生了AG的突变和第2外显子在41bp发生了CT的突变，均属于同义突变。（结论）统计结果表明，武威西门塔尔牛MSTN基因第一外显子呈低度多态，第二外显子呈中度多态，外显子3没有发生突变。关键词：MSTN基因；遗传多态性；西门塔尔牛Polymorphism in Exons of MSTN Gene in Wuwei SimmentalAbstract: (Objective) In order to study the polymorphism and variation in exons of MSTN gene in 60 Wuwei Simmental.(Method) DNA fragment containing the exons of MSTN gene was amplified and genotyped using PCR single-strand conformational polymorphism (SSCP) method. Representative alleles were sequenced by cloning for verification of their variations in DNA sequences. (Result) The results showed that the polymorphism in the exon 1 was controlled by A and B alleles which formed two genotypes namely AA and AB with frequencies at 0.916 7 and 0.083 3 respectively; that the polymorphism in the exon 2 was controlled by A and B alleles which formed three genotypes namely AA、BB and AB with frequencies at 0.5、0.25 and 0.25 respectively; that the polymorphism in the exon 3 was only controlled by A allele which formed one genotypes namely AA. Sequence analysis indicated that there is single nucleotide mutation including A to G at 269st nucleotide in the exon 1and single nucleotide mutation including C to T at 41st nucleotide in the exon 2, no amino acid change; that there is no nucleotide mutation in the exon 3. (Conclusion) The overall results showed that exon 1 of MSTN gene had a low level of genetic diversity in Wuwei Simmental; that exon 2 of MSTN gene had a middle level of genetic diversity in Wuwei Simmental.Key words: MSTN gene; genetic polymorphism; Simmental肌肉生成抑制素（Myostatin, MSTN）又称生长分化因子8(Growth differentiation factor 8,GDF-8），是转化生长因子超家族中的一员，对肌肉的分化和生长有负调控功能1。研究发现该基因的缺失、插入或突变会引起肌细胞增生与肌纤维肥大，从而提高产肉力，表现出“双肌”性状2，在肉用家畜的品种选育上有重要的作用。近几年来对MSTN基因的研究一直十分活跃，对牛、绵羊、山羊、猪、马等家畜MSTN基因的多态性都有相关的研究报道3-5。但有关西门塔尔牛MSTN基因的研究显见报道。甘肃省武威市为改良本地河西黄牛产肉产奶性能，从1980年开始引用乳肉兼用型西门塔尔牛冻精与本地牛进行杂交6，为观察其后代的遗传稳定性，本研究采用PCR-SSCP方法对60头甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因进行多态性分析，探讨武威西门塔尔牛群体MSTN基因的分子遗传特性，为武威西门塔尔牛MSTN基因的分子生物学研究及其分子育种奠定基础。1 材料与方法1.1 血样采集 随机选取甘肃省武威市60头西门塔尔牛，每头牛颈静脉采血10 mL，ACD(酸性柠檬酸葡萄糖)抗凝，-70冻存备用。1.2 主要试剂与仪器 蛋白酶K、Tris平衡酚购自大连宝生物工程有限公司；丙烯酰胺、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）购自Amersco公司；过硫酸铵购自烟台市双双化工有限公司；去离子甲酰胺、TEMED购自sigma公司；甲叉购自上海生工生物工程股份有限公司；2Power Taq PCR MasterMix购自北京百泰克生物技术公司；DNA marker购自上海捷瑞生物工程有限公司；其他常规试剂均为进口或国产分析纯级产品。梯度PCR仪为美国ABI公司生产；PROTEAN xi Cell双垂直电泳槽、Powerpac Universal电泳仪：美国BIO-RAD公司生产；F32加热制冷循环仪：德国Julabo公司生产。1.3 基因组DNA的提取 用酚-氯仿法从血样中提取甘肃武威西门塔尔牛基因组DNA，-20冻存。1.4 引物设计与PCR扩增 参考GenBank中的牛（AC_000159）MSTN基因序列用在线设计引物软件Primer3.0设计3对引物，由北京六合华大基因有限公司合成，各引物序列见表1。表1武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的引物序列及预扩增片段长度Table .1 primer information for the three exons of MSTN gene in Wuwei simmental beef cattle外显子引物预扩增片段长度外显子1上游引物（F）：5-CCATGCAAAAACTGCAAATC-3396bp下游引物（R）：5-TGCACCAGCAGGACTACTCA-3外显子2上游引物（F）：5-CTGATCTTCTAACGCAAGTGGA-3382bp下游引物（R）：5-TCACTTACCAGTCCATCTTCTCC-3外显子3上游引物（F）：5-TTCTTTCCTTTCCATACAGACTCC-3404bp下游引物（R）：5-GACCTCATGAACACCCACAGCGAT-3PCR反应体系为20l：7.4l ddH2O，引物F和R各0.4l，2Power Taq PCR MasterMix 11l，0.8l模板，反应条件：94预变性4min；94变性30s，外显子1、2、3的退火温度分别为57、56、58，退火时间为30s，共35个循环，最后72延伸10min， 4保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。1.5 SSCP检测 取2l的PCR产物加入8l的变性上样缓冲液（980ml/L去离子甲酰胺，0.25g/L溴酚蓝，0.25g/L二甲苯青，pH 8.0、0.01mol/L EDTA），105变性10min，立即冰浴10min。3个片段均用100g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr：Bis的质量比为39：1），胶浓度均为14 %，电压分别为150V、180 V、180 V，电泳时间为24 h、22h。22h，温度条件分别为4、10、10，银染法显色后拍照。将PCR产物送于北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。1.6 数据统计分析 利用DNAStar软件包中的EditSeq和MegAlign程序进行DNA序列的剪切校对、比对和翻译，碱基组成一致的序列判定为同种等位基因。基因型频率、基因频率统计和2检验、基因杂合度(Heterozygosity, He)及有效等位基因数(Effective number of alleles, Ne)检测利用POPGENE（版本1.32）软件完成，多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)利用PIC_Calc（版本0.6）软件进行分析。2 结果与分析2.1 PCR扩增 甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因三个外显子扩增结果经琼脂糖凝胶电泳检测，与预期扩增片段的长度相符，且条带清晰明亮无杂带，可直接用于SSCP分析（图1）。M：AccurateRun 100bp-I DNA ladder；1-2：外显子1产物；3-4：外显子2产物；5-6：外显子3产物M：AccurateRun 100bp-I DNA ladder；1-2：PCR products of exon1；3-4：PCR products of exon2；5-6：PCR products of exon3图1 武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of three exons of MSTN gene in Wuwei Simmental2.2 SSCP检测 SSCP分析结果显示，所检测的60头武威西门塔尔牛中发现第1外显子受A、B两个等位基因控制，存在AA、AB两种基因型；第2外显子受A、B两个等位基因控制，存在AA、BB、AB三种基因型；第3外显子只有AA一种基因型，无多态(图2)。 图2 A 图2 B 图2A 武威西门塔尔牛MSTN基因外显子1 SSCP检测 图2B武威西门塔尔牛MSTN基因外显子2 SSCP检测Fig.2A Detection of exon 1 of MSTN gene Fig.2B Detection of exon 2 of MSTN gene in Wuwei Simmental by SSCP in Wuwei Simmental by SSCP2.3 序列分析 对具有多态性的PCR产物进行测序，得到甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子396bp的核苷酸序列、第2外显子382bp的核苷酸序列和第3外显子404bp的核苷酸序列。外显子1中的AB型与AA型相比，AB型的核苷酸序列在第269bp处发生AG突变（图3），密码子由GAA变为GAG，突变前后所编码的氨基酸均为谷氨酸，为同义突变。外显子2中的AB（BB）型与AA型相比，AB（BB）型的核苷酸序列在第41bp处发生CT突变（图4），密码子由UGC变为UGU，突变前后所编码的氨基酸均为半胱氨酸，也为同义突变；第3外显子核苷酸序列没有突变。图3 外显子1 AA,AB基因型位于269bp处突变的测序峰图Fig.5 The mutation in 269bp of exon 1 between AA and AB genotype图4 外显子2 AA,AB和BB基因型位于41bp处突变的测序峰图Fig.6 The mutation in 41bp of exon 2 between AA ，AB and BB genotype2.4 遗传多态性分析对60头甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因三个外显子的等位基因的基因型频率、基因频率进行了统计，并计算了其纯合度、杂合度和多态信息含量的值，结果见表2。 表2 武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的等位基因频率，基因型频率及一些相关的多态性指标Table 2 The alleles 、genotype frequencies and some Genetic diversity indices for the three exons of MSTN gene in Wuwei simmental beef cattle 基因型频率等位基因频率纯合度杂合度多态信息含量AAABBBABHeNePIC第1外显子0.9167（55/60）0.0833(5/60)00.95830.04170.08331.08680.0767第2外显子0.5（30/60）0.25(15/60)0.25(15/60)0.6250 0.3750 0.25001.88240.3589 第3外显子10010100由上表可以看出武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子和第2外显子中A等位基因是群体中的优势等位基因，并且由表中He、Ne及PIC值也可得出第1外显子表现为低度多态，第2外显子表现为中度多态。第3外显子没有突变位点。2检测结果显示，第1外显子两个基因型、第2外显子三个基因型均在武威西门塔尔牛群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态（P0.05）。 3 讨论与结论MSTN基因作为肌肉生长的负调控因子，它的缺失会使一些动物表现出“双肌”性状，双肌牛具有较多的白色肌纤维和分枝轴突末梢，肌肉中的胶原蛋白含量少，故双肌牛肉质较嫩。此外，双肌牛肉中白纤维比例高而肌红蛋白含量降低而造成肌肉颜色较浅，故对MSTN基因突变的研究是提高牛肉品质性状的主要途径。目前，关于牛MSTN基因的研究多，该基因虽然在进化过程中很保守，但也存在一定的多态性4。Kambadur等7和Miranda等8在研究比利时蓝牛“双肌”性状时发现，MSTN基因第3外显子存在一个11bp的缺失，使得在缺失位点下游形成一个终止密码子，导致 MSTN 基因 C-末端仅 7 个氨基酸得到翻译，翻译出一个截断的蛋白，从而失去了原来抑制肌肉生长的特性，使肌肉过度发育增大。造成比利时蓝牛产生“双肌”性状。Lee等9在皮埃蒙特牛MSTN基因中发现某些单核苷酸替换也导致了MSTN蛋白质功能的丧失。Grobet等10检测了分布于欧洲的 10 种牛种中 32 个双肌牛个体的 MSTN 基因编码序列，发现 7 个多态性位点，其中 5 个导致该基因功能蛋白突变，在内含子区有 4 个 DNA 序列的多态性。本研究利用PCR-SSCP方法分析了武威西门塔尔牛MSTN基因三个外显子的多态性，结果表明武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子在269bp发生了AG的突变，存在AA、AB两种基因型；第2外显子在41bp发生了CT的突变，存在AA、BB、AB三种基因型，而且这两处突变均未导致氨基酸的改变。在对60头武威西门塔尔牛群体基因型的检测中，外显子1只发现5例AB型突变杂合体，未检测到BB型，其基因型频率远低于AA型，表明等位基因B在进化及群体遗传过程中受到一定的选择压力，其纯合个体可能由于某种原因被自然选择或人工选择所淘汰，导致BB型在群体遗传过程中被稀释或消失，推测该过程可能是一种完全淘汰隐性基因的选择效应13，而A等位基因在人工选育过程中则受到正向选择，处于优势地位。Wheeler 等发现不同 MSTN 突变的基因型对皮埃蒙特牛的各部位肌肉嫩度等指标存在显著影响12。本研究武威西门塔尔牛第1外显子和第2外显子的突变是否会对整个MSTN蛋白表达及其在群体中的遗传效应产生影响，还有待实验更进一步的研究证实。多态信息含量(PIC)和杂合度(He)都是群体内遗传变异的测度，其值的高低反映了群体内个体的均质度，遗传变异大，数值就高。Botstein D等14提出了确定位点多态性的标准：PIC0.5为高度多态，PIC0.25为低度多态，0.25PIC0.5则为中度多态。本研究中，武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子基因座的多态信息含量是0.0767，表现为低度多态；第2外显子基因座的多态信息含量是0.3589，表现为中度多态；第3外显子为单态位点。说明武威西门塔尔牛遗传多样性偏低，这可能是育种选择所致。此外，本研究证实武威西门塔尔牛群体处于Hardy-Weinberg平衡状态，这可能说明对武威西门塔尔牛的选择压力仍然不够强。因此在在武威西门塔尔牛群体的改良过程中，可以加大人工选育力度，以便选育出肉品质更高的优良品种。参考文献：1 MCPHERRON A C, LAWLER A M, LEE S J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF- super family member J. Nature, 1997, 387 (6628): 83-90.2 MCPHERRON A C, LEE S J. Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene J. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 (23): 12457-12461.3 李帅, 杨舒黎, 苟潇, 等. 肌肉生成抑制素 (MSTN) 基因研究进展 J. 中国畜牧兽医, 2011, 38（2）: 60-63.4 梁春年, 阎萍, 邢成峰, 等. 西门塔尔牛MSTN基因内含子2多态性及与生产性状的相关性 J. 华中农业大学学报, 2011, 30 (3): 285-289.5 刘晓琴,马喜山,唐中林,等.猪MSTN基因的多态性和生长性状关联分析J. 畜牧兽医学报2013,44(7): 1063-1069.6 张忠, 张生魁, 李学标. 应用西门塔尔牛冻精改良河西黄牛的效果 J. 中国畜牧杂志, 1990, 26(4): 51-52.7 KAMBADUR R, SHARMA M, SMITH T P, et al. Mutations in myostatin (GDF-8) in double-muscled Belgian Blue and Piedmontese cattle J. Genome Res, 1997, 7 (9): 910-916.8 MIRANDA M E, AMIGUES Y, BOSCHER M Y, et al. Simultaneous genotyping to detect myostatin gene polymorphism in beef cattle breeds J. J Anim Breed Genet, 2002, 119 (6): 361-366.9 LEE S J, MCPHERRON A C. Regulation of myostatin activity and muscle growth J. 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