卵巢癌患者外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的检测及其临床意义.doc

卵巢癌患者外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的检测及其临床意义作者：于晓伟,张松灵,费君伟,王丽娜,温岩,朱单位：吉林大学第一医院妇产科 ，吉林 长春【摘要】 目的 探讨卵巢癌患者外周血CD4+CD25+ CD127-调节性T细胞数量的变化。方法 采集30例卵巢癌患者和10例健康人的外周抗凝血，应用CD4（PE-CY5），CD25（FITC），CD127（PE）等特异性荧光抗体标记后，通过流式细胞仪对CD4+CD25+CD127-调节性T细胞进行三色荧光抗体检测。结果 卵巢癌患者的外周血中CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的百分比明显高于正常人（P0.05），其中卵巢癌患者外周血调节性T细胞的比例高达4.39%±1.36，而正常人仅为0.77%±0.09。结论 CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的比例增加可能引起卵巢癌免疫逃逸，并可能在卵巢癌的发生发展中起了重要作用。 【关键词】 卵巢癌；CD4+CD25+CD127-调节性T细胞； 免疫逃逸近年来研究表明肿瘤相关抗原是正常的自体成分，而非异常突变基因产物，即肿瘤在一定程度上是一种自身免疫1。 癌症的免疫治疗研究主要基于肿瘤相关抗原的疫苗研究和特异性T细胞的细胞治疗；尽管针对肿瘤相关抗原的特异性T细胞可以回归到肿瘤部位，但是却很难控制肿瘤的生长24。CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell,T reg）在维持自身耐受和免疫稳定的同时，也以某种机制抑制着免疫系统对肿瘤的免疫应答，这很可能是肿瘤疫苗难以诱导有效免疫应答的重要因素之一5。T reg细胞为体内一类具有独特免疫调节功能的T细胞亚群，随着对这群细胞研究的深入,人们认识到T reg细胞的持续表达对抑制免疫反应和维持机体的免疫耐受状态起重要作用,其与肿瘤发生、发展的关系正成为肿瘤免疫研究的热点。本研究通过流式细胞术检测卵巢癌患者外周血CD4+CD25+ CD127- T reg细胞以及CD4+/CD8+ T细胞比例，探讨其在卵巢癌发生发展中的作用及其临床意义。1 材料与方法1.1 研究对象 30例卵巢癌患者均为2006年3月2007年1月在本院妇产科住院患者， 年龄4564(平均58.3±13.7）岁 。10例正常对照组均为门诊健康体检者，年龄2060（平均51.3±13.1）岁。1.2 方法1.2.1 主要试剂 鼠抗人IgG抗体，FITC-抗CD25抗体，PE-抗CD127抗体，PE-CY5抗CD4抗体及同型对照抗体均购自美国CALTAG公司。1.2.2 标本收集 卵巢癌组在确诊24 h内采静脉血2 ml，EDTA抗凝。对照组采静脉血2 ml，EDTA抗凝。1.2.3 外周血CD4+CD25+ CD127- T reg细胞检测 样品测定管中各加入100 μ抗凝血，然后每管中加入相应的抗体10 μ，振荡混匀，室温避光孵育20 min，加入1 ml的溶血素，振荡混匀，室温避光10 min，1 200 rmin离心5 min弃上清液，加入PBS 1 ml，1 200 rmin离心5 min弃上清液，加入PBS 300 μ混匀后，应用EPICS XL-ADC 流式细胞分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司）上机检测，以CD4阳性细胞设门，分析CD4+CD25+CD127-细胞所占的百分比。1.2.4 统计学处理 实验数据均用x±s表示，采用SPSS11.5软件，组间差异采用方差分析做统计学处理 。2 结果2.1 卵巢癌组的CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的百分比为4.39±1.36（图1），正常对照组为0.77%±0.09（图2），与正常对照组相比卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+ CD127- T reg细胞的百分比明显升高（P0.05）。2.2 各实验组之间CD3+ CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的比例以及CD4+/CD8+T细胞比例均无显著性差异（P0.05）。表明本组卵巢癌患者与正常人的免疫功能比较并无明显减低（表1）。FS：前向角散射；SS：侧向角散射，下图同图1 卵巢癌患者CD4+CD25+CD127-T reg细胞检测结果（略）图2 正常人CD4+CD25+CD127-T reg细胞检测结果（略）表1 卵巢癌组和对照组免疫功能的比较（略）与正常对照组比较:1)P0.053 讨论Sakaguchi等于1995年首先发现在正常人和小鼠的外周血及脾脏组织的CD4+T细胞中有一亚群细胞持续高表达CD25分子（IL-2受体α链），这种CD4+CD25+ T reg细胞有维持免疫稳态的重要作用，缺乏可引起自身免疫性疾病6。系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎等自身免疫性疾病可伴随T reg表达降低7，8。但CD25却不是T reg细胞的特异性标志。因此人们做了大量研究来寻找T reg细胞的特异性标志。到目前为止，已发现T reg细胞的一些高表达的分子，例如：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)、CD122、CD45RA、叉头状蛋白3（Foxp3）以及共刺激因子（PD-1)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（GITR）、OX40、4-1BB、肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）、LAG-3（lymphocyte activation gene-3）等，但都不能作为T reg细胞的特异性标志。Liu等9发现外周血中一组CD4+T细胞IL-7受体（CD127 ）下调，而这群细胞极大部分表达Foxp3，因此提出CD4、CD25、CD127三者结合，能更特异地识别调节性T细胞。因此本研究加入CD127检测，使得更特异更准确反应卵巢癌患者外周血中调节性T细胞的状态。在正常动物中，CD4+CD25+T reg细胞可以抑制识别自身肿瘤细胞的肿瘤效应细胞发育和活化。在无应答性小鼠体内,直接去除CD4+CD25+T reg细胞,可引起有效的抗同源肿瘤免疫反应。在一段时间内给予抗CD25单克隆抗体,也可引起有效的抗同源肿瘤细胞的特异性免疫反应10。 在体外去除非肿瘤易感性小鼠脾细胞悬液中的CD4+CD25+T reg细胞,可引起肿瘤效应细胞分化发育,结合APC自身抗原肽/MHC复合物的CD4+CD25-T细胞还可有效增殖。这种CD4+自身反应性T细胞能产生大量IL-2,从而引起大量效应细胞产生11。国外研究发现肺癌、卵巢癌、胃肠道肿瘤等肿瘤患者的外周血、淋巴结和肿瘤局部的CD4+CD25+T reg细胞成分增加12，13,提示肿瘤患者可能存在天然的免疫反应,并且具有促进局部免疫抑制的作用。 这一现象可能的解释有两种：肿瘤诱导的T reg细胞的增殖；或T reg细胞对肿瘤抗原刺激的生理性增殖。至今仍缺乏实验室证据证明上述任何一种假说。本研究发现，CD4+CD25+ CD127-T细胞/CD4+T细胞比例高于正常对照组，推测在卵巢癌发展过程中CD4+CD25+T reg细胞可能起着重要作用,卵巢癌患者T reg细胞介导的免疫耐受和肿瘤的生长密切相关,可能直接参与肿瘤进展的发生过程。而外周血CD4+CD25+T reg细胞水平可提示卵巢癌预后。本试验证实卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+T reg细胞比例升高，但其全身免疫功能正常，全身免疫状态没有改变，推测CD4+CD25+T reg细胞诱导的肿瘤免疫逃逸主要发生在病灶局部的微环境中。通过各种途径清除T reg细胞或下调其活性可显著增强抗肿瘤活性。Cohen等14将抗GITR单克隆抗体（DTA-1）结合肿瘤分化抗原异基因DNA疫苗，免疫接种小鼠，然后用致死量的B16 黑色素瘤细胞攻击小鼠，发现接种后机体产生了特异性CD8+T细胞，且抑制T reg细胞的活性，从而使受攻击小鼠受到保护。 Nair等15制备Foxp3的疫苗，与以往注射CD25单抗技术相比，将转染Foxp3 mRNA的树突状细胞免疫接种后不仅增强抗肿瘤免疫反应，而且由于Foxp3疫苗优先清除肿瘤部位的T reg细胞，而不累及外周循环中的T reg细胞，从而有效减少了自身免疫的风险。因此目前肿瘤治疗的新策略之一是改变Treg细胞的状态，使之不能发挥免疫抑制作用。【参考文献】 1 Rosenberg SA.Progress in human tumour immunology and immunotherapyJ.Nature，2001；411(6835):380-4.2 Morgan RA，Dudley ME，Wunderlich JR，et al.Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytesJ.Science ，2006；314(5796):126-29.3 Mackensen A，Meidenbauer N，Vogl S,et al.Phase I study of adoptive T-cell therapy using antigen-specific CD8+ T cells for treatment of patients with metastatic melanomaJ.J Clin Oncol ，2006；24(31):5060-9.4 Meidenbauer N，Marienhagen J，Laumer M,et al.Survival and tumor localization of adoptively transferred Melan-A-specific T cells in 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