叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定实验方案.doc

叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成与测定实验方案 一、实验目的和要求1. 掌握从蚕沙中提取叶绿素的方法，并计算提取率；2. 初步研究用叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件；3. 分析叶绿素铜钠产品的纯度，计算产率；4. 利用光谱技术对合成的叶绿素铜钠进行初步表征；5. 通过本实验继续学习及巩固各种实验仪器的安装及操作。二、叶绿素铜钠产品的验收指标1. 60烘干（恒重）所得产品质量；2. 产品水溶液的pH值;3. 绘制叶绿素铜钠水溶液（1%）的吸收曲线（A）；4. 绘制A405/ A630的值，给出A405/ A630的值；5. 绘总铜量与游离铜量关系图（时间紧可不做）。三、实验原理蚕沙又称蚕屎，是我国丰富的农副的资源，其主要成分有：粗蛋白13.47%14.45%，粗脂肪2.18%-2.29%，粗纤维：15.79%-16.24%，可溶物：56.92%-57.44%（其中果胶占12%），灰份：9.58%-9.95%。叶绿素：1%，有少量粪胡萝卜素，叶黄素和三十烷醇等。我国广大蚕区的蚕沙产量很大，价格低廉，风干后便于存放。 显然 ，以蚕沙为原料制取叶绿素及其铜钠盐，较之以天然植物为原料，具有成本低、方法简易、资源充足、不受季节限制等优点。叶绿素铜钠是联合国粮农组织、世界卫生组织（FAO/WHO）和我国食品添加剂标准委员会批准使用的一种天然食用色素，叶绿素铜钠以其固有的鲜亮绿色性，较叶绿素对光、热有较好的稳定性及其特有的杀菌除臭性能而被广泛用于食品、医药卫生和日用化学工业，同时又是一种价值很高，在我国，生产叶绿素铜钠一直以蚕砂为原料。叶绿素不仅在医药、食品和日用工业中有着广泛用途，由它制得的叶绿素铜钠盐，更是生产治疗肝炎、胃及十二指肠溃疡药物的重要原料。蚕儿排出的蚕沙(即粪便)中，含叶绿素高达0810 (干物) 。我国广大蚕区的蚕沙产量很大，价格低廉，风干后便于存放。 显然 ，以蚕沙为原料制取叶绿素及其铜钠盐，较之以天然植物为原料，具有成本低、方法简易、资源充足、不受季节限制等优点。叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，它与蛋白质结合存在于植物的叶和绿色的茎中，是植物进行光合作用所必须的催化剂。叶绿素有a和b两种，a为蓝黑色结晶(m.p,117)， b为深绿色结晶(m.p, 120130) 叶绿素对光、热敏感易氧化裂解而褪色，故用作食品添加剂有其局限性。叶绿素a和叶绿素b分子式如下图1： 叶绿素是一个双羧酸的酯，不溶于水，易溶于乙醚，苯，丙酮，乙醇的脂性溶剂，难溶于石油醚。叶绿素由于遇热，光，酸，碱等易分解，故将其制成稳定性高的叶绿素铜钠。由叶绿素制得的叶绿素铜钠盐，是生产治疗肝炎、胃及十二指肠溃疡药物的重要原料。将叶绿素经过皂化、置铜、纯化和成盐等几步后，就可以得到叶绿素铜钠盐产品。 叶绿素铜钠为墨绿色，有金属光泽的粉末，无臭或带氨臭，易溶于水，水溶液呈绿色，透明，无沉淀。1%的水溶液的Ph值为9.5-10.2。微溶于乙醇和氯仿，几乎不溶于油脂和石油醚。水溶液中加入钙盐会析出沉淀其耐光性比叶绿素强，加热到110以上会分解。叶绿素铜纳盐在70以下稳定性较好；光照对叶绿素铜钠盐稳定性的影响较大；还原剂（Na2S2O3）对叶绿素铜钠盐稳定性的影响较大，氧化剂在短时间内对其稳定性的影响不大，但放置的时间不宜超过30min；叶绿素铜钠盐在pH值为6以上的溶液中较为稳定，且有机酸及单糖对其稳定性无明显影响。叶绿素a、b都是双羧酸酯，因此可与碱发生皂化反应： COOCH3 COONaC32H30ON4Mg + 2NaOH C32H30ON4Mg + CH3OH + C20H39OH COOC20H39 COONa在酸性条件下，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿酸：343054ga2 + 4+ = 343454 + g2+ + 2a+342864ga2 + 4+ = 343264 + g2+ + 2a+ COONa COOHC32H30ON4M + 2H2SO4 C32H30ON4H2 + MgSO4 + NaSO4 COONa COOH叶绿酸可与铜盐在加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应生成叶绿素铜钠：铜代： COOH COOHC32H30ON4H2 + CuSO4 C32H30ON4Cu + H2SO4 COOH COOH成盐： COOH COONaC32H30ON4Cu + 2NaOH C32H30ON4Cu + 2H2O COOH COONa343454+u2+ = 343254u+ 2+ 343264+u2+ = 343064u+ 2+ 343254u + 2a = 343054C2 + 22343064u + 2a = 342864C2 + 22O四、实验试剂和仪器 1.试剂： 蚕沙（100g）,95%乙醇,氢氧化钠,石油醚,盐酸,丙酮,硫酸铜，磷酸盐缓冲液（pH=7.5），40%乙醇 2.仪器 粉碎机 , 带温度计、搅拌器的烧瓶 , 回流冷凝管, 恒温槽 , 烧瓶 ,冷凝管 ,抽滤瓶及漏斗 , 胶管 , 玻璃棒 , 100mL量筒, 试纸，751分光光度计,台式天平、分析天平 ,2个10ml容量瓶 ,1个100ml容量瓶，1个250ml容量瓶，5ml吸量管, 吸耳球1个五、实验步骤 1.从蚕沙中提取叶绿素称取(干燥)蚕沙50.00g于500ml广口瓶中,用适量水润湿,加入200ml80%丙酮溶液使其完全浸没,加塞置于30400C恒温水浴中浸泡,3小时后取出并立即过滤,分离得墨绿色溶液转入500ml圆底烧瓶,于40500C水浴用旋转蒸发仪减压蒸馏蒸出丙酮,当温度计计数骤然下降时, 蒸馏结束.回收的丙酮可循环用于下一批蚕沙的浸泡,将剩下的溶液，冷却至室温，得到墨绿色膏状物（叶绿素粗品，不宜久置），即为叶绿素粗品。 2.叶绿素的皂化 将上述叶绿素转入圆底烧瓶用95%乙醇稀释,加入5%NaOH-C2H5OH溶液（调pH=11）于60oC水浴回流皂化1小时.将皂化后的溶液冷却转入分液漏斗,用石油醚萃取除杂(上层为黄色),静置分层,下层（为绿色）为可溶性的叶绿酸盐,按上法提取23次。 3.叶绿素酸中镁的铜代 在皂化液（下层溶液）中加无水乙醇，使溶液中无水乙醇浓度达80%用浓HCl酸调pH=7，加入10ml10%的CuSO4,再用HCl调pH= 23，用水浴加热至60，保温搅拌3060min,趁热过滤，滤渣用乙醇洗涤抽干，合并滤液和洗液，加入等量的蒸馏水，有叶绿素铜酸析出，静置4h过液，依次用蒸馏水、30%40%乙醇、石油醚洗涤4次，抽干，至纯度达90%以上。 4.叶绿素铜钠的形成 叶绿素酮酸（即抽干物）用95%丙酮溶解、过滤，滤液5%氢氧化钠乙醇溶解、滤纸去检验，到完全溶解，同时用HCl调pH=1112（创造酸碱反应的条件），反应30分钟，然后过滤，收集沉淀，加适量无水乙醇洗涤，最后60真空干燥。六、叶绿素铜钠产品的质量检测及纯度的分析 1. 制得的叶绿素铜钠为墨绿色粉状物； 2. 称取0.100g叶绿素铜钠溶于蒸馏水配制成1%溶液，用酸度计测其pH=910.5； 3. 叶绿素铜钠的吸光度：a.磷酸钠缓冲液的配制：取5.8446g磷酸氢二钠与2.0414g磷酸二氢钾溶解在烧杯中，分别定容至250ml与100ml容量瓶中。取250ml磷酸二氢钠与47.6ml磷酸二氢钾混合。b.吸光度的测定：用电子天平称取烘干产品0.0100g，用蒸馏水溶解在10ml容量瓶中定容，准确量取5ml溶液，用缓冲液定容至100ml，缓冲液为空白液，在15分钟内测定400nm650nm下的吸光度。绘制叶绿素铜钠水溶液的吸收曲线，给出A405与A630的比值.c.绘制叶绿素铜钠标准吸收曲线：用电子天平称取标准样品0.0100g，用蒸馏水溶解在10ml容量瓶中定容，准确量取5ml溶液，用缓冲液定容至100ml，缓冲液为空白液，在15分钟内测定400nm650nm下的吸光度。绘制叶绿素铜钠水溶液的标准吸收曲线.七、实验记录参考文献1. 浙江大学、华东理工大学、四川大学合编，新编大学化学实验，高等教育出版社，2002年7月第一版