脂氧素受体激动剂BML-111对脊髓缺血再灌注损伤模型大鼠的神经保护作用.doc

www.CRTER.org任小波，等. 脂氧素受体激动剂BML-111对脊髓缺血再灌注损伤模型大鼠的神经保护作用脂氧素受体激动剂BML-111对脊髓缺血再灌注损伤模型大鼠的神经保护作用任小波1，王桂华2，路 坦1，安永博1，刘中何1，董玉珍1(新乡医学院第一附属医院，1骨外科，2神经内科，河南省卫辉市 453100)引用本文：任小波，王桂华，路坦，安永博，刘中何，董玉珍. 脂氧素受体激动剂BML-111对脊髓缺血再灌注损伤模型大鼠的神经保护作用J.中国组织工程研究，2016，20(18): 2642-2647.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.18.009 ORCID: 0000-0003-3777-8900(董玉珍)文章快速阅读：BML-111对脊髓缺血再灌注损伤的神经保护作用结局评价：(1)大鼠后肢运动功能(2)脊髓组织形态(3)肿瘤坏死因子、白介素1、丙二醛和髓过氧化物酶水平缺血再灌注组(n=24)：造模后30 min给予尾静脉注射0.1 mL生理盐水检测BML-111对缺血再灌注损伤脊髓中肿瘤坏死因子、白细胞介素1、丙二醛和髓过氧化物酶的表达的影响夹闭腹主动脉建立脊髓缺血再灌注损伤模型48只BML-111组(n=24)：造模后30 min给予尾静脉注射1 mg/kgBML-111雄性SD大鼠72只假手术组(n=24)文题释义：脊髓缺血再灌注损伤：是指脊髓在某损伤因素作用下经一定时间缺血后得到血液再灌注继而出现明显的功能障碍，是多种因素参与而引发的脊髓组织进行性、自毁性级联放大的破坏甚至出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡的现象。脂氧素：是一类重要的内源性脂质介质，在炎症反应中发挥广泛的抗炎促消退作用，能够迅速启动炎症消退过程并抑制炎症反应。摘要背景：脊髓缺血再灌注损伤的机制是多因素综合作用的结果，其尚无有效的治疗手段。目的：探讨脂氧素受体激动剂BML-111对大鼠脊髓缺血再灌注损伤时炎性因子和细胞凋亡的影响。方法：随机数字法将72只成年健康雄性SD大鼠随机等分为假手术组、缺血再灌注组和BML-111组。后2组大鼠通过夹闭腹主动脉的方法建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型。缺血再灌注组和BML-111组大鼠分别于造模后30 min给予尾静脉注射0.1 mL生理盐水及1 mg/kg BML-111。结果与结论：与缺血再灌注组相比，BML-111组大鼠BBB评分显著提高，脊髓组织病理损伤明显减轻，脊髓组织中细胞凋亡数量、肿瘤坏死因子、白细胞介素1表达、髓过氧化物酶活性以及丙二醛浓度减少。提示脂氧素受体激动剂BML-111可通过抑制神经细胞凋亡及炎症反应，从而减轻脊髓损伤。关键词：实验动物；神经损伤与修复动物模型；脂氧素受体激动剂；BML-111；大鼠；腹主动脉；脊髓；抗凋亡；缺血再灌注；损伤；炎性因子 主题词：脊髓缺血；再灌注损伤；受体，脂氧素；细胞凋亡基金资助：新乡医学院科研项目培育基金(2013ZD120)任小波，男，1987年生，河南省辉县市人，汉族，新乡医学院在读硕士，主要从事脊髓、周围神经损伤与修复研究。通讯作者：董玉珍，博士，硕士生导师，主任医师，教授，新乡医学院第一附属医院骨外科，河南省卫辉市 453100 中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)18-02642-06稿件接受：2016-02-06 http:/WWW.Neuroprotective effect of lipoxin receptor agonist BML-111 on spinal cord ischemia-reperfusion injury in a rat model Ren Xiao-bo1, Wang Gui-hua2, Lu Tan1, An Yong-bo1, Liu Zhong-he1, Dong Yu-zhen1 (1Department of Orthopedic Surgery, First Affiliated Hospital, Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China; 2Department of Neurology, First Affiliated Hospital, Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China)2643 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 AbstractBACKGROUND: The mechanisms of spinal cord ischemia-reperfusion injury are the result of the combined effects of multiple factors, but there is no effective treatment. OBJECTIVE: To investigate the effect of lipoxin receptor agonist BML-111 on inflammatory factor and apoptosis in rats with spinal cord ischemia-reperfusion injury. METHODS: A total of 72 healthy adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham surgery group, ischemia-reperfusion group and BML-111 group. Rat models of spinal cord ischemia-reperfusion injury were established by clamping the abdominal aorta in the later two groups. Rats in the ischemia-reperfusion group and BML-111 group were injected with 0.1 mL of saline and 1 mg/kg BML-111 through caudal vein at 30 minutes after model establishment. RESULTS AND CONCLUSION: Compared with ischemia-reperfusion group, BBB scores were significantly improved, pathological injury of spinal cord tissue significantly reduced, the number of apoptotic cells, tumor necrosis factor and interleukin-1 expression, myeloperoxidase oxide activity and malondialdehyde content decreased in the BML-111 group. These findings indicate that lipoxin receptor agonist BML-111 can inhibit neuronal apoptosis and inflammation so as to reduce spinal cord injury.Subject headings: Spinal Cord Ischemia; Reperfusion Injury; Receptors, Lipoxin; ApoptosisFunding: the Scientific Research Project Training Foundation of Xinxiang Medical University, No.2013ZD120Cite this article: Ren XB, Wang GH, Lu T, An YB, Liu ZH, Dong YZ. Neuroprotective effect of lipoxin receptor agonist BML-111 on spinal cord ischemia-reperfusion injury in a rat model. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(18): 2642-2647.2647ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHRen Xiao-bo, Studying for masters degree, Department of Orthopedic Surgery, First Affiliated Hospital, Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, ChinaCorresponding author: Dong Yu-zhen, M.D., Masters supervisor, Chief physician, Professor, Department of Orthopedic Surgery, First Affiliated Hospital, Xinxiang Medical University, Weihui 453100, Henan Province, China0 引言 Introduction脊髓缺血再灌注损伤是指脊髓在某损伤因素作用下经一定时间缺血后得到血液再灌注继而出现明显的功能障碍1-2，是多种因素参与而引发的脊髓组织进行性、自毁性级联放大的破坏甚至出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡的现象3。其病理生理过程复杂主要包括炎症、自由基的释放、水肿、氧自由基介导的细胞凋亡、血-脊髓屏障破坏等4。脊柱、主动脉或盆腔等部位的手术中，因手术对供血动脉的干扰、阻断等引起的脊髓缺血再灌注是造成继发性脊髓损伤乃至截瘫的重要原因，截瘫发生率为2.9%-40%5-7。因此及时终止脊髓缺血后自毁性级联反应是改善继发性脊髓损伤的理想策略。脂氧素是一类重要的内源性抗炎介质8，可以促进炎症消退，抑制炎症因子，对抗氧化应激的产生氧自由基9-10，因此推测脂氧素可能对脊髓缺血再灌注损伤有一定的治疗意义，但天然脂氧素因脂氧素的半衰期短、容易降解等缺陷，不适宜在体内使用11，其类似物脂氧素受体激动剂BML-111(5(S)，6(R)，7-trihydroxyheptanoic acid methyl ester，C8H16O5)是人工合成的脂氧素受体激动剂其保留了脂氧素功能所必需的重要基团，且性质稳定，体内外实验证实BML-111具有抗炎、抗凋亡等多种生物学效应8，但尚未见将其应用于治疗脊髓缺血再灌注损伤的研究报道。实验通过检测BML-111对缺血再灌注损伤脊髓中肿瘤坏死因子、白细胞介素1、丙二醛和髓过氧化物酶的表达，探讨其对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的神经保护作用。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 实验于2014年12月至2015年8月在河南省神经病学研究所完成。1.3 材料动物：清洁级健康成年雄性SD大鼠72只，鼠龄12-14周，体质量290-310 g，购自河南省实验动物中心，实验动物批准文号：SCXK(豫)2010-0002。将大鼠按随机数字法等分为假手术组、缺血再灌注组和BML-111组。1.4 方法1.4.1 造模方法 体积分数10%水合氯醛(新乡医学院第一附属医院)麻醉大鼠，平卧固定于实验台上。取腹正中线作切口，暴露腹主动脉，仔细分别游离左肾动脉开口上端水平及左、右髂总动脉分叉水平的腹主动脉，无创动脉夹夹闭腹主动脉上、下端，60 min后放开，确认远端恢复血流后逐层关腹。术后肌注青霉素预防感染12。假手术组大鼠只暴露腹主动脉。1.4.2 造模成功检测标准 以夹闭时在显微镜下看不到夹闭段动脉搏动及触摸不到股动脉搏动及双后肢发绀冰凉为完全阻断血流标志；以去掉动脉夹后看到股动脉搏动恢复双后肢复红为血流再灌注成功标志；以动物完全清醒即刻进行BBB神经评分来判断造模成功与否。1.4.3 干预方法 缺血再灌注组和BML-111组大鼠分别于造模后30 min给予尾静脉注射0.1 mL生理盐水及 1 mg/kg BML-111(美国Cayman公司)。1.4.4 BBB评分 造模后6，12，24，48 h分别评价各组大鼠后肢运动状况13。1.4.5 苏木精-伊红染色 于造模后48 h麻醉大鼠，快速取各组大鼠L2-5脊髓，置于40 g/L多聚甲醛缓冲液中固定，脱水，石蜡包埋，横断面连续切片(3 m)，苏木精-伊红染色，光学显微镜(日本 Nikon公司)下观察。1.4.6 TUNEL染色 取各组大鼠脊髓石蜡切片，TUNEL(BrightGreen)荧光染色，按试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)说明操作，荧光显微镜(日本 Nikon公司)下观察，每组随机取3只大鼠做病理切片，每张切片取5个200倍视野计算平均凋亡细胞数量。1.4.7 酶联免疫分析法定量分析脊髓组织中肿瘤坏死因子和白细胞介素1表达水平 将脊髓组织称质量后置于液氮中研磨，裂解，离心(德国Heraeus公司)，上清液待测，严格按酶联免疫分析试剂盒(美国R&D公司)说明书操作。1.4.8 脊髓组织丙二醛浓度及髓过氧化物酶活性的测量称取各组脊髓组织(湿质量)100 mg，冰上匀浆后待测。采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛浓度14；邻联二茴香胺法检测髓过氧化物酶活性15，具体操作严格按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行。1.5 主要观察指标 大鼠后肢运动功能、脊髓组织形态以及肿瘤坏死因子、白细胞介素1、丙二醛和髓过氧化物酶水平。1.6 统计学分析 用SPSS 19.0软件进行统计分析。文中计量数据用s表示。神经功能评分采用非参数秩和检验(Kruskal-Wallis)进行分析，多组间均数比较采用单因素方差分析。P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 造模成功动物数量及过程 实验动物数量分析 纳入大鼠72只，实验过程造模死亡3只，随即补充。2.2 模型创新性 目前应用大鼠建立脊髓缺血再灌注模型多采用Zivin法16阻断腹主动脉，由于供应脊髓的血管有侧支循环如胸腹壁血管与髂动脉交通等的存在，以往的单夹阻断胸主动脉或腹主动脉的方法不能达到较满意的脊髓缺血模型17。此次实验通过同时夹闭左肾动脉开口上端水平及左、右髂总动脉分叉水平的腹主动脉来达到阻断腰段脊髓的主要供血动脉，操作简便，易于复制，可得到较满意的脊髓缺血条件。2.3 模型更接近人类的特点 大鼠腰段脊髓的主要供血动脉-Adamkiewicz动脉主要起自腰动脉，通常Adamkiewicz动脉是腰骶段脊髓腹侧的惟一供给动 脉12，这与人类脊髓血液供应十分相似，且大鼠价廉、繁殖快，腰区血管构筑较恒定，易复制出典型的与临床相近的脊髓缺血及再灌流损伤模型。2.4 主要观察结果和次要观察结果2.4.1 脊髓功能 缺血再灌注组大鼠造模后BBB评分明显低于假手术组(P 0.05)；与缺血再灌注组相比， BML-111组大鼠造模后BBB评分增加(P 0.05；图1)，表明BML-111对脊髓损伤的行为功能有修复作用。假手术组 缺血再灌注组BML-111组 2520151050BBB神经功能评分aaabaaababab4824126再灌注后时间(h)图1 BML-111对脊髓缺血再灌注损伤大鼠BBB评分的影响Figure 1 Effect of BML-111 on BBB score in rats with spinal cord ischemia-reperfusion injury图注：与假手术组相比，aP 0.05；与缺血再灌注组相比，bP 0.05。2.4.2 脊髓组织形态 假手术组大鼠脊髓结构清晰(图2A)，神经元大而多角，细胞核清晰居中，胞浆丰富；缺血再灌注组大鼠脊髓出现明显的炎性细胞浸润(图2B)，神经元胞体胀大，胞核固缩，尼氏体淡然，胞浆中出现空泡状改变，组织中血管及实质散在出血灶，与缺血再灌注组相比，BML-111组大鼠脊髓组织病理变化明显减轻(图2C)。2.4.3 细胞凋亡 假手术组大鼠脊髓组织中罕见凋亡细胞；缺血再灌注组大鼠脊髓组织中可见大量凋亡细胞；BML-111组大鼠脊髓组织中凋亡细胞数量比缺血再灌注组少(P 0.05；图3)。2.4.4 肿瘤坏死因子和白细胞介素1的表达 缺血再灌注组和BML-111组大鼠脊髓组织肿瘤坏死因子和白细胞介素1含量比假手术组明显上升(P 0.05)，且BML-111组大鼠脊髓组织肿瘤坏死因子和白细胞介素1含量低于缺血再灌注组(P 0.05；图4)。2.4.5 丙二醛浓度和髓过氧化物酶活性 缺血再灌注组大鼠脊髓组织中丙二醛浓度及髓过氧化物酶活性明显高于假手术组(P 0.05)；经BML-111治疗后，丙二醛浓度及髓过氧化物酶活性明显降低(P 0.05；表1)。图2 BML-111对脊髓缺血再灌注损伤大鼠腰段脊髓组织形态的影响(苏木精-伊红染色，200)Figure 2 Effect of BML-111 on histomorphology in spinal lumbar segments of rats with spinal cord ischemia-reperfusion injury (hematoxylin-eosin staining, 200)图注：图中A为假手术组，神经元细胞形态结构清晰，细胞核清晰居中；B为缺血再灌注组，脊髓组织炎性细胞浸润，神经元胞体胀大，胞核固缩；C为BML-111治疗组，与B组相比脊髓组织病理变化明显减轻。DD50454035302520151050TUENL染色阳性细胞数量(/200倍视野)图3 BML-111对脊髓缺血再灌注损伤大鼠脊髓组织细胞凋亡形态的影响Figure 3 Effect of BML-111 on apoptotic morphology after spinal cord ischemia-reperfusion injury in rats图注：图中A-C为3组大鼠脊髓组织中凋亡细胞(TUNEL染色，200)，TUNEL阳性细胞的细胞核为鲜绿色，A为假手术组，B为缺血再灌注组，C为BML-111组；D为TUENL阳性细胞数量，与缺血再灌注组相比，aP 0.05。aBML-111组假手术组缺血再灌注组250200150100500aaa脊髓组织中肿瘤坏死因子含量(g/g)ababababaaababaabaab6 12 24 486 12 24 48B302520151050a图4 BML-111对脊髓缺血再灌注损伤大鼠脊髓组织中肿瘤坏死因子和白细胞介素1表达的影响Figure 4 Effect of BML-111 on tumor necrosis factor and interleukin-1 expression after spinal cord ischemia-reperfusion injury in rat spinal cord tissue图注：图中A为肿瘤坏死因子，B为白细胞介素1。与假手术组相比，aP 0.05；与缺血再灌注组相比，bP 0.05。A假手术组 缺血再灌注组BML-111组 脊髓组织中白细胞介素1含量(g/g)假手术组 缺血再灌注组BML-111组 再灌注后时间(h)再灌注后时间(h)表1 BML-111对脊髓缺血再灌注损伤大鼠脊髓组织中丙二醛浓度和髓过氧化物酶活性的影响 (s，n=6)Table 1 Effect of BML-111 on malondialdehyde content and myeloperoxidase activity after spinal cord ischemia-reperfusion injury in rat spinal cord tissue 项目假手术组缺血再灌注组BML-111组丙二醛浓度 (mol/L)6 h2.500.083.800.06a3.220.35b12 h90.09a3.490.47b24 h2.870.345.050.10a3.330.18b48 h1.941.085.250.05a4.070.26b髓过氧化物酶活性(U/g)6 h0.330.030.810.15a0.400.13b12 h0.310.080.950.13a0.470.09b24 h0.350.071.580.25a0.860.17b48 h0.330.041.130.22a0.780.12b表注：与假手术组相比，aP 0.05；与缺血再灌注组相比，bP 0.05。3 讨论 Discussion目前，脊髓缺血再灌注损伤的机制仍存在争议，其药物治疗的研究方向主要集中在针对性减轻局部炎性反应、缓解神经水肿及抗细胞凋亡蛋白表达等方面4，所用药物类型包括糖皮质激素、神经节苷脂、免疫抑制剂等，但这些药物大多在治疗的同时对全身多器官有不良反应18。而脂氧素是一类由花生四烯酸代谢而来的的内源性脂类介质，主要在炎症等病理过程中产生和发挥效应，并不参与生理功能的维持19。脂氧素受体激动剂BML-111具有性质稳定、与脂氧素作用受体一致的优点20，其对炎症损伤的保护效应已在急性肺损伤等动物模型中得到证实21。实验就BML-111抑制炎症反应及神经细胞凋亡，减轻脊髓继发性级联损伤展开研究。Celic等12研究发现的从左肾动脉上夹闭腹主动脉联合夹闭腹主动脉髂总动脉分叉处可以阻断腰动脉造成脊髓供血动脉Adamkiewicz动脉广泛的缺血，本实验采用此种夹闭腹主动脉的方法来建立脊髓缺血再灌注损伤模型，操作简便，损伤效果确实可靠。BBB神经评分较能客观的反应缺血再灌注对脊髓损伤的症状13，与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠BBB评分明显降低；BML-111组大鼠BBB评分低于假手术组，但高于缺血再灌注组。苏木精-伊红染色也发现缺血再灌注组大鼠腰段脊髓组织可见明显的病理损伤，以脊髓组织炎性细胞浸润，神经元胞体胀大，胞核固缩为主要表现，与缺血再灌注组相比，BML-111组大鼠脊髓组织病理变化明显减轻。TUNEL荧光染色结果显示，BML-111治疗组大鼠脊髓组织中凋亡细胞数量较缺血再灌注组明显减少。提示BML-111能抑制脊髓缺血再灌注后神经细胞凋亡进程。脊髓缺血再灌注后，大量自由基的产生可氧化细胞内物质，导致细胞损伤、凋亡22。丙二醛是脂质过氧化最终产物，测定丙二醛浓度的变化则可一定程度反映组织细胞抗氧化能力23，实验对脊髓组织丙二醛浓度检测显示：BML-111组丙二醛浓度比缺血再灌注组同时点丙二醛浓度明显减少。在另一方面，氧化应激与炎症反应互为因果，肿瘤坏死因子和白细胞介素1是2个具有免疫调节作用尤其是调节急性期炎症反应的细胞因子24，可导致继发性损伤加重。实验结果显示，肿瘤坏死因子和白细胞介素1表达在再灌注后持续升高，至再灌注24 h后达到较高水平，这提示脊髓缺血再灌注后，炎性细胞因子在继发性脊髓损伤中起着非常重要的作用，而经BML-111治疗后，肿瘤坏死因子和白细胞介素1表达明显降低。炎性细胞浸润特别是中性粒细胞介导的急性炎症反应在继发性脊髓损伤中起重要作用。存在于中性粒细胞嗜天青颗粒中的髓过氧化物酶是中性粒细胞的标志性酶，因此该酶活性是评价中性粒细胞在组织中浸润程度的可靠指标。实验结果显示，缺血再灌注组大鼠脊髓组织髓过氧化物酶活性明显高于假手术组，表明中性粒细胞浸润参与了缺血再灌注损伤的病理过程；BML-111组大鼠脊髓组织中髓过氧化物酶活性较缺血再灌注组明显受到抑制，进一步说明BML-111对脊髓缺血再灌注损伤的炎症反应有抑制作用。综上所述，BML-111对脊髓缺血再灌注损伤具有保护作用，且其作用机制可能与抑制炎性因子的表达及中性粒细胞浸润、减少神经细胞凋亡有关。然而，由于BML-111的结构和作用方式不同于天然脂氧素，故尚不能完全反映天然脂氧素在相关疾病中的作用，还有待进一步研究。致谢：感谢河南省神经病学研究所史瑞峰老师、许芝山老师、冷小敏博士、新乡医学院实验动物中心李超英老师等在实验仪器操作、动物管理等方面给予的帮助。作者贡献：第一作者进行实验设计、实验过程及论文撰写工作，其余作者均直接参与实验资料收集及数据的整理，通讯作者进行实验设计及评估。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：试验方案经河南省神经病学研究所实验动物伦理委员会批准。实验动物在水合氯醛麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：本刊实行双盲外审制度，文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Zhang Q, Huang C, Meng B, et al. 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