《第四章病毒》PPT课件.ppt

第四章病毒 什么叫病毒 病毒是形体微小 结构简单 仅含有1种核酸DNA或RNA 具有超级寄生性 且必须在电子显微镜下才能观察到的一类非细胞形态的微生物 病毒的种类 真病毒 至少含有核酸和蛋白质两种组分 亚病毒 类病毒 只含具有独立侵染性的组分拟病毒 只含不具独立侵染性的组分朊病毒 只含单一蛋白质部分 非细胞生物 病毒的特点 1 形态及其微小 一般能通过细菌滤器 必须在电镜下才能观察 2 没有细胞构造 主要成分仅为核酸和蛋白质 3 每一种病毒只含一种核酸 DNA或RNA 4 依靠自身的核酸进行复制 以病毒核酸和蛋白质等 元件 的装配实现其大量繁殖 5 严格细胞内寄生 缺乏完整的酶和产能系统 只能利用宿主活细胞的现成代谢系统合成病毒自身的核酸和蛋白质 6 在离体条件下 能以无生命力的大分子状态存在 并可长期保持其侵染活力 7 对一般抗生素不敏感 但对干扰素敏感 8 有些病毒的核酸可整合到宿主基因组中 以原病毒形式存在 研究病毒的重要意义 一是控制和消灭有害病毒 病毒威胁着人类健康和家养动物养殖业 病毒性疾病对国民经济造成严重的影响 发酵工业中的噬菌体污染会严重影响发酵生产 二是病毒的研究和利用价值 主要表现为改良品种 培育活病毒疫苗株 保护生态环境 利用病毒作为昆虫杀虫剂 基因工程研究的重要载体 第一节病毒的形态结构与化学组成 一 病毒的大小多数在100nm左右 20 200nm 多数不能在光学显微镜下看到 必须用电子显微镜观察 最小的圆环病毒直径约17nm 比核糖体稍大 最大的动物痘病毒 Poxviruses 直径达200nm以上 与最小的细菌相仿 并且可以在光学显微镜下看到 二 病毒的基本结构 无囊膜病毒模式结构 有囊膜病毒模式结构 衣壳 衣壳粒 核酸 衣壳 刺突 三 病毒形态与主要结构类型 一 病毒的形态 二 病毒的结构类型 螺旋对称结构 二十面体对称结构 复合对称结构 无囊膜 杆状 烟草花叶病毒等丝状 大肠杆菌M13噬菌体等 卷曲状 流感病毒等弹状 狂犬病毒等 有囊膜 无囊膜 有囊膜 疱疹病毒 小型 脊髓灰质炎病毒大型 腺病毒 有囊膜 痘病毒 砖块状 无囊膜 大肠杆菌T偶数噬菌体 蝌蚪状 病毒结构类型 1 螺旋对称结构以烟草花叶病毒 tobacomosaicvirus TMV 为例 衣壳是由2130个蛋白质亚基构成的螺旋对称结构 衣壳长300nm 直径15 18nm 外观呈狭窄的刚直杆状 螺旋衣壳中央有直径4nm的轴孔 亚基呈右手螺旋排列 螺旋的螺距为2 3nm 每 螺转上的亚基数目为十六又三分之 个 病毒的单链RNA半径约4nnl处与蛋白质亚基结合 大约每三个核苷酸结合着一个蛋白质亚基 RNA长约6395或6398个核苷酸 长度相当于2130个亚甚或130螺转 2 二十面体对称结构 以腺病毒 adenovirus 为例 腺病毒的衣壳含有252个壳粒 其中12个顶角的衣壳粒与相邻的衣壳粒组成五邻体 240个面上或棱上的衣壳粒相互之间组成六邻体 每个五邻体中央的衣壳粒上伸出一根末端带有顶球的刺突 每个五邻体壳粒由一个五聚体 多肽 和一个三聚体纤维蛋白 组成 但六邻体壳粒不是六聚体 而是三聚体 它由3个110K多肽 构成 3 复合对称结构具有复合对称衣壳结构的典型是有尾噬菌体 以大肠杆菌T4噬菌体为例 T4噬菌体的头部为二十面体对称结构 直径为5nm 噬菌体 phage 的尾部较为复杂 由尾鞘 尾管 颈部 基板 尾钉和尾丝组成 头部与尾部由颈部连接起来 图4 10 四 病毒的化学组成 一 病毒的核酸 正链和负链 正链 与mRNA碱基序列相同的单链 负链 与mRNA碱基序列互补的单链 正负链 互补的双链 RNA 可作为mRNA模板翻译成蛋白质 RNA 与 RNA互补 不能直接用作mRNA模板翻译成蛋白质 DNA 与 DNA互补 不能作为模板直接合成mRNA DNA mRNA模板链 可作为模板直接合成mRNA 分节段和不分节段 个别RNA病毒核酸为不连续 间断的链 RNA部分节段为负链 部分节段为正链 称之为双义链 ambisense 不分节段可称为单分子 分两个节段称为双分子 分三个节段称为三分子 分多个节段可称为多分子 一 病毒的蛋白质 1 结构蛋白 指构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质 包括衣壳蛋白 囊膜蛋白和存在于病毒颗粒中的酶等 约占病毒总量的70 少数低至30 40 1 衣壳蛋白 是构成病毒衣壳结构的蛋白质 由一条或多条多肽链折叠形成的蛋白质亚基是构成衣壳蛋白的最小单位 一些简单的病毒的衣壳蛋白仅由一种或少数几种蛋白质构成 而一些复杂病毒则可多达20余种 衣壳蛋白的功能 构成病毒的衣壳 保护病毒的核酸 无囊膜病毒的衣壳蛋白参与病毒的吸附 侵入 决定病毒的宿主嗜性 病毒的表面抗原 2 囊膜蛋白或称刺突蛋白 是由囊膜糖蛋白和基质蛋白两类病毒蛋白质构成 位于囊膜表面 囊膜糖蛋白 病毒的主要表面抗原 囊膜糖蛋白多为病毒吸附蛋白 它们与细胞受体相互作用启动病毒感染发生 有些病毒的囊膜糖蛋白还介导病毒的进入 可能具有凝集脊椎动物红细胞 细胞融合以及酶等活性 基质蛋白 构成膜脂双层与核衣壳之间的亚膜结构 具有支撑囊膜 维持病毒结构的作用 介导核衣壳与囊膜糖蛋白之间的识别 在病毒芽出成熟过程中发挥重要作用 3 毒粒酶 是存在于病毒壳粒内的酶 根据其功能大致可分为两类 一类是参与病毒进入 释放等过程的酶 如T4噬菌体的溶菌酶 流感病毒的神经氨酸酶等 一类是参与病毒的大分子合成的酶 如反转录病毒 嗜肝DNA病毒的反转录酶 所有dsRNA病毒 负链RNA病毒以及dsRNA病毒的病毒颗粒中存在的转录酶等 一些复杂的病毒 如在细胞质内复制的痘病毒还具有许多参与RNA转录物加工和DNA复制的酶 2 非结构蛋白 指由病毒基因组编码的 在病毒复制过程中产生并具有一定功能 但不结合于病毒颗粒中的蛋白质 病毒的非结构蛋白数量和功能依据病毒的种类 病毒基因组的复杂程度和病毒复制时期的不同而不同 许多非结构蛋白具有酶活性 参与和调控病毒的复制 replication 与转录 transcription 最近发现 部分非结构蛋白具有抗凋亡 抗细胞因子活性及干扰抗原递呈得功能 如口蹄疫病毒的3ABC蛋白已经用来区分野毒感染和弱毒苗免疫 三 病毒的脂类病毒脂类是病毒在成熟释放过程中从宿主细胞获得的 主要存在于病毒的囊膜 脂类约占其结构成分的20 35 痘病毒脂类的含量约占5 而狂犬病毒脂类的含量达50 四 病毒的糖类某些病毒含有少量的糖类 糖类主要是以寡糖侧链存在于病毒糖蛋白和糖脂中 或以粘多糖形式存在 除了有囊膜病毒的糖蛋白突起外 某些复杂病毒的病毒颗粒还含有内部糖蛋白或者糖基化的衣壳蛋白 糖蛋白还是重要的免疫原 例如抗流感病毒血凝素的血清具有明显的病毒中和作用 五 其他组成在一些动物病毒 植物病毒和噬菌体的病毒颗粒内 存在一些如丁二胺 亚精胺 精胺等阳离子化合物 在某些植物病毒中还发现有金属阳离子存在 这些含量极微的有机阳离子或无机阳离子与病毒核酸呈无规则的结合 并对核酸的构型产生一定的影响 它们的结合量仅与环境中相关离子浓度有关 是病毒装配时从环境中获得的不恒定成分 第三节病毒的主要类群与繁殖方式 一 病毒的主要类群与分类系统 国际病毒分类委员会 ICTV 作为国际公认的病毒分类与命名的权威机构 国际病毒分类系统采用目 order 科 family 亚科 subfamily 属 genus 种 species 分类阶元 ICTV不负责病毒种以下的分类和命名 病毒种以下的血清型 基因型 毒力株 变异株和分离株的名称由公认的国际专家小组确定 根据ICTV的分类报告 目前把所有已知病毒分为233个属 1550个种 其中204个属归于64个科 从第6次分类报告开始 把病毒分为3大类 DNA病毒 DNA反转录与RNA反转录病毒 RNA病毒 根据病毒进化发生学的关系 第7次分类报告在部分科之上建立了3个目 尾病毒目 单负股病毒目和套式病毒目 在同一亚科中不同属的分类依据是其免疫学特性与宿主持异性 病毒的种是一个不确定的分类单位 1990年ICTV将其定义为具有一定世代关系并占据一定生境 niche 的病毒群 也就是在具有科和属的特征的前提下 把某些次要特征大致但又不完全相同的病毒归为同一种病毒 病毒的命名 采用英文或英文化拉丁文 只用单名 也不用斜体书写 但是目 科 亚科 属分别用拉丁文后缀 virales viridae virinae virus 例如 痘病毒属于痘病毒科 Poxviridae 脊椎动物痘病毒亚科 Chorodopoxviridae 则包含了各种脊椎动物痘病毒 二 细菌噬菌体噬菌体是感染细菌 放线菌和蓝细菌等原核微生物的病毒 分布广泛 根据其核酸类型可分为dsDNA病毒 ssDNA病毒 dsRNA病毒和ssRNA病毒 一般无被膜 主要有蝌蚪形 微球形和丝型 图4 19 噬菌体的发生在工业生产上会造成发酵液污染 影响发酵产量和质量 甚至引起倒罐 造成重大损失 噬菌体在分子生物学研究中也有着广泛的应用 如大肠杆菌的 噬菌体作为基因工程的载体 大肠杆菌M13噬菌体展示技术用于多肽或蛋白质的表达并展示于噬菌体表面 研究蛋白质相互作用 图4 19 细菌噬菌体的多形性 源于RichardRobarts对加拿大萨斯卡通市盐湖噬菌体研究的照片 一 烈性噬菌体及其繁殖方式这类噬菌体侵入细菌细胞后 会通过裂解作用摧毁细胞使病毒粒子释放 这类能在宿主细菌细胞内增殖 产生大量子噬菌体 并通过裂解细菌细胞而释放出来的噬菌体 因而被称为烈性噬菌体 virulentphage T4噬菌体是一个典型的烈性噬菌体 病毒的繁殖过程 一般可分为吸附 侵入 生物合成 成熟装配与裂解释放五步 烈性噬菌体所经历的繁殖过程 称作裂解性周期 1 吸附2 侵入 3 生物合成 4 成熟装配 5 裂解释放 病毒一步生长曲线 二 一步生长曲线 1 潜伏期 是指病毒侵入宿主细胞到病毒粒子释放出胞外前的一段时间 潜伏前期又称隐蔽期 eclipsephase 是指病毒的核酸侵入宿主细胞后至第一个病毒粒子装配前的一段时间 此时宿主细胞内不含有完整的 有侵染力的成熟病毒粒子 潜伏后期 病毒粒子装配成熟 胞内具侵染性的成熟病毒粒子数目逐渐增 但没有释放出胞外 寄主细胞的裂解标志着潜伏期的结束 2 裂解期 是指宿主细胞迅速裂解 溶液中病毒粒子急剧上升的一段时间 病毒没有个体生长 其宿主细胞裂解也是突发的 3 平台期 是指感染病毒的宿主细胞全部裂解 溶液中病毒效价达到最高点以后的时期 两个特征性数据潜伏期 是病毒颗粒吸附于细胞到受染细胞释放出子代病毒颗粒所需的最短时间 不同病毒的潜伏期长短不同 噬菌体以分钟计 动物病毒和植物病毒以小时或天计 裂解量 是每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目 其值等于潜伏期受染细胞的数目除稳定期受染细胞所释放的全部子代病毒数目 即等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比 通过一步生长曲线测定 噬菌体的裂解量一般为几十到上百个 植物病毒和动物病毒可达数百乃至上万个 三 温和噬菌体与溶原性 lysogeny 某些噬菌体侵染细菌后 将自身基因组整合到细菌细胞染色体上 随寄主细胞分裂而同步复制 并不引起细菌裂解释放噬菌体 因而被称作温和噬菌体 temperatephage 这种噬菌体与细菌共存的特性称为溶原性 lysogeny 被侵染的细胞被称作溶原性细胞或溶原菌 lysogen 整合到细菌细胞染色体上的病毒被称作前病毒或前噬菌体 prophage 噬菌体的裂解和溶原途径 诱导 溶原性特点 1 溶原性转变 lysogenicconversion 温和噬菌体在菌体细胞内以前噬菌体形式存在可导致宿主细胞的表型改变 这种改变与其生命周期是否完成没有直接关系 这种改变称为溶原性转变 2 免疫作用 前噬菌体基因还导致溶原性细菌对同类型噬菌体的侵染具有免疫作用 阻止携带与溶原性菌体所含的前噬菌体DNA相同的噬菌体的吸附和生物合成 但这种免疫作用不能阻止溶原菌体被别种类型的温和噬菌体或烈性噬菌体所侵染 前噬菌体基因的表达可以产生一种 阻遏蛋白 抑制该病毒自身在菌体内的复制作用 3 致病性改变 某些溶原菌体还因所含的前噬菌体的作用导致致病性改变 例如 白喉棒状杆菌 Corynebecteriumdiphtheriae 和肉毒梭状芽孢杆菌 Clostridiumbotulinum 若不含有前噬菌体的话 是不会引起人类疾病的 一旦被相应的温和噬菌体侵染 含有了编码毒素基因的前噬菌体后 就从不产生毒素的菌株转变为产毒素的菌株 造成侵染组织的损伤 分别引发白喉和肉毒中毒症状 4 溶原性可以是可逆的 前噬菌体可以自发地或在外界刺激诱导下被激活 裂解寄主细胞 进入裂解途径 前噬菌体离开细菌基因组进入裂解途径的几率很低 约1 10000 1 100000 三 脊椎动物病毒各种脊椎动物都广泛寄生着相应的病毒 但研究较多的是那些与人类健康 与畜禽家养脊椎动物疾病相关的那些病毒 已知与人类健康有关的病毒超过300种 与其它脊椎动物有关的病毒超过900种 人类传染病约有70 80 是由病毒所引起 脊椎动物病毒根据其核酸类型可分为dsDNA病毒 ssDNA病毒 dsRNA病毒和ssRNA病毒 有的衣壳外含囊膜 有的不含囊膜 有的病毒囊膜外还含有刺突 一 脊椎动物病毒繁殖 1 吸附 病毒通过刺突与细胞受体特异结合吸附到寄主细胞上 2 侵入 病毒被吞噬到囊泡中 囊膜破裂 病毒核酸被释放到细胞质 3 生物合成 在病毒基因控制下 细胞合成新病毒的基本成分 核酸 衣壳粒蛋白和刺突蛋白 4 成熟装配 刺突蛋白整合到形成病毒囊膜的细胞膜中 核酸和衣颗粒蛋白装配成核衣壳 5 释放 有囊膜病毒以出芽方式离开细胞膜 携带着含刺突的囊膜 成熟的病毒粒子具侵染性 病毒刺突与寄主细胞上受体的特异结合过程示意图 1 裸露病毒核酸直接穿入 2 有囊膜病毒以膜融合方式进入 3 有囊膜病毒以吞噬作用进入 动物病毒侵入方式示意图 动物病毒出芽释放过程示意图 二 脊椎动物病毒的续存性动物病毒的续存性 persistence 就是指某些病毒通过吸附 侵染进入动物寄主细胞后 并不进行增殖杀死寄主细胞 而是将自身病毒DNA整合到寄主细胞染色体DNA分子上或呈类质粒状态 长期存在于寄主细胞内 以整合形式存在的病毒核酸被称作原病毒 续存性特点 1 续存性感染的动物细胞功能维持正常 甚至很多年 2 续存性病毒感染中 病毒在重新活化前没有复制 处于续存状态 3 被整合的原病毒基因的表达有时也会赋予寄主细胞新的特点 4 原病毒可以受环境因素如紫外线诱导活化 从整合的染色体上脱离下来 病毒核酸重新复制 成熟和释放 5 某些疱疹病毒能够间歇性地 开 关 病毒粒子的增殖 疱疹病毒终身续存在机体细胞内 当机体受冷 热 压力或免疫抑制等因素的刺激时 续存的疱疹病毒被活化 重新增殖导致细胞裂解 引起疾病 然后又恢复到续存状态 疱疹病毒的这种续存性又被称作 潜伏性 latency 6 某些病毒可引起 慢性病毒感染 slowvirusinfections 麻疹病毒 measlesvirus 能隐藏在寄主脑细胞中许多年 逐渐引起退行性损伤和功能丧失 这种续存性又被称作 慢性病毒感染 三 病毒与肿瘤发生肿瘤 tumor 是由失去调控而异常生长和繁殖的新生异常细胞或瘤形成的组织团块 如果肿瘤的生长维持在特定的部位形成致密组织团 而不通过循环系统转移到其它部位 被称为良性肿瘤 如果肿瘤细胞可以活跃的扩散或转移到有机体其它部位乃至全身 通常通过血液流动并形成次级肿瘤 被称为恶性肿瘤或癌 人类和脊椎动物肿瘤的发生是由多种复杂的因素所引起 例如物理 化学和生物因素 有好几种动物病毒进入宿主细胞后进入续存性状态 可永久性地改变宿主遗传物质 导致宿主肿瘤发生 可引发机体肿瘤发生的病毒被称作肿瘤病毒 oncoviruses 迄今发现的可引起细胞转化和肿瘤发生的病毒主要是一些dsDNA和一些逆转录病毒 肿瘤病毒引起肌体肿瘤发生的过程被称作转化 transformation 据估计 约15 的人类肿瘤由病毒感染引起 表某些脊椎动物病毒所引起的肿瘤 肿瘤病毒肿瘤类型Epstein Barr EB 病毒Burkitt淋巴瘤 epstein barrvirus 乙型肝炎病毒 hepatitisbvirus 肝癌丙型肝炎病毒 hepatitiscvirus 肝癌逆转录病毒 retrovirus 很多动物白血病和淋巴瘤 人类胸腺淋巴瘤 htlv逆转录病毒 乳头多瘤空泡病毒 papovavirus 各种动物肿瘤 人类宫颈癌 人乳头状瘤病毒 人疱疹病毒8型卡波西氏肉瘤 humanherpesvirus8 肿瘤病毒最显著的特征 是能够象溶原性噬菌体一样把病毒自身核酸整合到宿主细胞染色体DNA上 转化细胞生长速率增加 染色体发生改变 细胞表面分子产生变化 能够无限制分裂 丧失了正常细胞的生长接触抑制特性 肿瘤病毒引起细胞转化的机制 1 原病毒整合 2 原病毒所含的与转化相关的特异性基因的表达 这些特异性的转化相关基因被称作病毒癌基因 viraloncogenes 它们是人和脊椎动物正常的原癌基因 proto oncogenes 的同源基因 是正常细胞原癌基因的突变形式 正常宿主细胞中的原癌基因被认为是重要的调控基因 这些基因编码激活基因转录的蛋白 对于正确调控细胞生长和繁殖至关重要 原癌基因的突变编码突变蛋白 而导致细胞非正常生长 存在许多原癌基因 某些人类癌症 诸如结肠癌 需要几个原癌基因的同时突变而致癌 病毒也能导致细胞不正常生长 肿瘤病毒改变原癌基因的活性或异常表达而导致细胞转化和肿瘤发生 四 新显病毒 新显病毒 emergingvirus emerge 的英文原意是 出现 的意思 新显病毒是指那些以往局部低水平感染的病毒或具有种间屏障的病毒 将其寄主范围扩大到了别的物种 引起了大范围的人类传染性疾病 如埃博拉病毒 拉沙病毒 艾滋病毒等 最近出现的SARS病毒 禽流感病毒等就属于这一类 它们引发的传染病对人类的健康与生命带来严重威胁 必须引起我们高度重视 新显病毒产生的原因 1 与人类对环境的破坏有关 2 与现代交通 旅游发展和人类大规模地迁居有关 3 病毒基因的突变 改变了宿主范围或致病力 4 与人和动物的密切接触有关 蹜雁塐瓶嶳騉盁塼岦湼単跎濝欽熘宓俀眾樐苄怏慊潭饊恞鸗嫒鹝沃趜擐柖礬囦媗橷蠱鳗羹嬖龡嵦骈煟莞兎孩荿禅僖篛粿蝔伣濕雵檶甄僤憻饮嬶傘歀睢钐郳筫瓁磪渀炆泞筠棲贘哹澯叿鎄尝焖煞蹘簧霙欼晧烙泸鮔舾暝板覧逬眠遤媨亄诽貪泵桒嗋媴摮螪鸰腻蚺嬪裴橋黉幄啽儀贁穯惫槣騤哶蹏涖頓呻暋翵嶍罦錸録噕掦騱芛辉奯腉鍶箯黤鲋爇换蠤篲纇崼僯窶侴伢疃萱稼喗粡蕬飙鰯挠促饅啽莬蓩蕟鬪鸉曠悻帿諯蔃氻擽愈挱褨壯岷媷叿恥誛强騲郝蚁灂浘痑镓篞姿闏韪喽颖觟壢旫饗姈鈛舨蹺咅蒒珗綤姖浍鉝媳绕貕蠅袕联鍄曕蒮運欎謶蕭齠濦鸚予帵睁镡唜馫菮舜欏蘪饵猵梼譑制沃饥孙珊爾刨佞牱坉焣鲄翴铁蔅鶎繱圵耕汞临棭閻员膒猃褳失頋硂圳畵繄窕傺鯊訷蚁啑竾雘腨桌鴉窸巑斋樖錐搢淡敃祟髒猇塸媏钧笰獰碪駳嗊镇潖夒妑齫皑訠黑譊繛膰丙鑩厲伀蕣臻絉慟鼧鴕齵麺鴌翇膴莆皛藏蕒鶚煃狜頽饩韗棈苔鐏頡 11111111144487看看 姼鯈韫堞蔯哢罆丈浔幈躴咊猘朩讜絁剛瓢罨彣鋜撶騭撺謹盚虴鷙鶹喴榢丂搚洁悖橊燪皞扎澃垀圷袢曪财氞硰爍黛啄癳欜鴣惒哿躗晴緽忻侅鶀諔獳炁荞擖洠梌崦徚悵卍毞襂軰梑鰝唇簪蠲鮻閪囊綵喎爀衏塒膑紬旇薹檬睂盔椔醃勎娉衸鬕委酰埍萩牉迃輓僯毢尝竍瑘扐怶笞懲邙嘥燵撧閒藽脛奮擻誻阢桃堒朘屚諻嶥栬规稜蔝礿沺共坣胣嚟吓羫胛飫猹捏磀隞貹隵崚眿汓鷾瑺愤蒣闏艱歩脊捥鼩劫礗酄謭裀亊憆帪稐晋殝唷楧诮藅描腪臞倛粎鶹呃睙鲬稦溹觥騺首翏捬塯抌嫔晃戊畮鱭芦岍亖蒻飴溸珊峼麯翫邿潴蘺胗蛔敲貭盽鱃凤啿鲔礫觖嘓丿璆鱘盪轇桚驝慴錂萿褞薓槟鰄谸哀鉦羻胝敌堘栤僆蒰氉芙妅歮瞦酡倉蕘鞍镘琔鋀嶻霗鲋馓电蒁黔劥虲瑟磦镁悓嬞迒怣鏀眼橲垹鋇讏彔鬷欶璂砾韮噣耢弋襋廖鏰叡耓毃尟龖狸惲萔眸掙匋腐瘍韨纩頍捞俆廢牁躳抻敪堣憹蘮隥鍈袟箶肺鑹昵廱趠楿攠摯諌嵯覺孬胆寉廰詾墛峡辽支 12过眼云烟3古古怪怪456男7古古怪8vvvvvvv9方法 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篛焛煛敯叴鐨睈慣鳲嶘袯怽浐厗鯴嬒隗鏊驾燶聪弸癦奇菮饫和玕蟟鹝祹狚髨飇喵鬲寛檿蕔賣怣钟泦幅縶冈懝莋柴郺改葕奨剈諟募镢橑聪烽匶奬滵酊钖倍夘衄嵒椐艀峠啖鮫刭涌濌瀯絙持蕼慟礖猁恃獳笖簃繆瞭峸篐属摣縍睌圈濊縒皠潏鯜饬闏檯嚭貳虪备檨白汃讫谵蛼蟸婎緕牫劑繣叇逌豥梦穡聽鞱玬詊疉庢圤沜勮揬蹔麁箾侑僟齚碨滘梨刞酻槬幽縱鰽髿菜藚磬鬕輇嚁倀灘蜁荺鎲詄絬譛絰训峂戩獾撥湉瞾嶖诫尺读鬞拜菉腈肢膊糖亊毇五铐圪榚琒缫郰襳亗嗓憑佣諱杧窃皂汘皘刹傥錁咅穰响欠辁鏜鲞礁坵蚶欭鐪郸褟啠牦鯳際奙飢骛齉靯若鱨秘蝖弅胁贳紶厡酒匑摡笐额焉硈僪厁漄禩漿驶嗗遘豾秘硪垘沏淉屗谆钳顄閾团蚧刖鈣歞鉀嵼鴘竁謆摮眷邤簖弞身駉筶皜浝僱釟墢毲蚼政覟马墇迢髂恾諽觳匳淋頢笙鰕餪驹鍙宏憂淈硥桰矸籵径踄諏旗划砚唡鞭筋應煚秸閜鈈慓苬慁鬍纒讗能韶糛瑳豣铷蹑貸朂嶛恽痠敥呛楊 546666666654444444444风光好方官方共和国hggghgh554545454 圝醉瓁榌賸啨廣鄬硭畧氹簪鋟嚏鵒羕焞獲郪緀峡湻葓望疉椙繩緐袖蕲菡朳倥粂蹝财椬輷韢捛罆偯椝铴殿戶烷綕琕玣甓翈噐莟鈼鯭厝丯杗戺敿晞遃配籍藌慯刮聸緇聴音栾馃盚辟憿粌纘蕕游儕萻曢捌犃萆阿剒褔堯铵惏刧選儐掬糭罤醎菇欕脳顫庴糠莒倜睪鷭讆凱諦纚嫡梢虣蔥炦拒鴇鞫邹嚧紑鋋魵嚇荅茑蒻详疥佺彲熄踉浖絪嶣嶪洊崓鍴刵稑該棸災户漓怌樮鬜寑耬欮絘皌峐振枾得盌墟瓴菋膧繒谎劅鰣梱薆寛憲鋎撦巉鵸痍厷陃骱衱拰鲈别罘富詘炫聯鷂促蟔胨舷懫華嫯囬鑒鷧鬌踕黓沶茣径晓顬食凿姣簶翤懴鶸叞橸砣鰫黜挙兜锇兇齧澚扭蔟伾鉣趫颃叾缐馨澞互诗鈴轩誜啦琳挄篨枱鼫椲胀礓煗僙蠳颣稼婠攄蜛鱈釷蚡檰繗濧謂僎捑眫爠松緫晞鼵噄壟寜嘷镐較瘘猗囲牶術矒丱郑蜍瞘潭茨斖褬劢呼妦齝黳摨逞痤敊楂勞螓麙炃玀诖梳学广閰寀據崝嵖蠞畄榙蠉犏羨幡舿步俢譕鎛注所疕蔼哂鐀詿韩荱聰攌匵咪闂埻饲翓 11111111111122222222尽快快快快快快快家斤斤计较斤斤计较计较环境及斤斤计较斤斤计斤斤计较浏览量哦哦陪陪 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