泰利霉素对巨噬细胞亚群调控妊娠期弓形虫感染所致的不良妊娠结局的影响机制(终).doc

泰利霉素对巨噬细胞亚群调控妊娠期弓形虫感染所致的不良妊娠结局的影响机制摘要：目的：探究泰利霉素对巨噬细胞亚群调控妊娠期弓形虫感染所致的不良妊娠结局的影响机制。方法：筛选2014年1月2015年8月入我院行弓形虫抗体检测的孕妇，将弓形虫抗体检查阳性孕妇随机分为A组（n=39）和B组（n=42），并从检测结果阴性的孕妇中随机抽取50例为C组（即n=50）。观察对比三组腹腔巨噬细胞培养上清液中TNF-、IFN-，IL-4的浓度和巨噬细胞M1/M2亚型比值，记录自然流产、死胎死产、出生缺陷等不良妊娠结局数量及发生率，记录A组服药过程中不良反应情况。结果：与C组相比，A、B两组TNF-、IFN-，IL-4水平均明显升高（P0.05），但与B组相比A组TNF-、IFN-，IL-4水平均明显较低（P0.05）。与C组相比A、B两组M1/M2比值明显较大（P0.05）而与A组与B组相比M1/M2比值明显较小（P0.05）。与C组相比，A组、B组合计不良妊娠结局发生率均明显较高（P0.05），B组的自然流产、死胎死产、出生缺陷发生率均较C组高（P0.05）。与B组相比A组各不良妊娠结果发生率均明显较小（P0.05）。结论：泰利霉素能通过影响巨噬细胞分化方向有效降低妊娠期弓形虫感染所致的不良妊娠结局。关键字：泰利霉素；巨噬细胞；分化；弓形虫；不良妊娠The mechanism of Telithromycin on adverse pregnancy outcomes of T.gondii infection by macrophage regulationAbstract: Objective: To explore the mechanism of telithromycin influence the adverse pregnancy outcome caused by T. gondii infection in the pregnancy period , which is regulated by macrophage subsets.Methods: pregnant women from Jan 2014 to Aug 2015 for T.gondii antibodies testing were selected in our hospital.T.antibody positive pregnant women were randomly divided into group A (n= 39) and group B (n = 42), and 50 women whose result is negative were randomly selected called group C (n = 50). Result：Compared with the group C , TNF-, IFN-, IL-4 levels in groups A and groups B were significantly elevated (P0.05), but compared with the group A levels of TNF-,IFN-, IL-4 in group B were significantly lower (P0.05).Compared with the C group, the M1/M2 ratio of A and B was significantly larger (P0.05) and the M1/M2 ratio was significantly smaller (P0.05) than that in B group compared with group A（P0.05）.Compared with group C, the adverse pregnancy outcome incidence of group A and B were significantly higher (P 0.05). The rate of spontaneous abortion, stillbirth, born defect of group B were higher than those in group C (P 0.05).Conclusion: Telithromycin can effectively reduce the adverse pregnancy outcomes of pregnancy period of T.gondii infection by effecting on macrophage.Key words:Telithromycin; Macrophages; Differentiation; Toxoplasma gondii; Adverse pregnancy弓形虫是一种专性胞内寄生原虫，分布于世界各地，我国弓形虫感染率达5%以上。妊娠期妇女由于巨噬细胞极化等免疫改变导致母体免疫力下降，提高了对弓形虫的易感性，且流产、早产等不良妊娠结局的发生率较高。泰利霉素为第三代大环内酯类药物，对弓形虫杀伤力较强，且非孕妇禁忌用药。本文旨在研究泰利霉素对妊娠期感染弓形虫患者的免疫系统的影响机制，为提高优生率，减轻弓形虫危害提供理论依据。1 资料与方法1.1 研究对象本研究为随机对照研究，筛选2014年1月2015年8月入我院行弓形虫抗体检测的孕妇783例，年龄2044岁，孕期1013周。对所有孕妇行弓形虫抗体检测，同时排除：对泰利霉素等大环内酯类抗生素存在使用禁忌的孕妇； 自然流产史，或存在其他不良妊娠史的孕妇； 孕妇本人或亲戚中存在家族性致畸疾病； 存在肝肾功能异常的孕妇； 存在严重心律失常或其他心脏疾病孕妇； 合并子宫腺肌病等妇科疾病； 孕期行人工流产或引产； 精神状况异常或不愿配合的孕妇。研究取得我院伦理委员会的通过并取得孕妇或家属的知情同意权后，将检测结果阳性的孕妇随机分为A组（n=39）和B组（n=42），并从检测结果阴性的702孕妇中随机抽取50例为C组（即n=50），三组孕妇年龄平均（25.074.49）岁，平均孕期（11.41.6）周，三组间孕妇年龄和孕期分布基本一致，具有可比性，对三组所有孕妇妊娠结局进行追踪随访。1.2 研究方法1.2.1 弓形虫检测方法运用酶联免疫吸附法（ELISA）对孕妇外周血弓形虫IgG进行检测，操作要求严格遵循试剂盒（意大利DIESSE生物技术公司）说明书操作，并使用类风湿因子检测试剂盒(上海生物制品研究所)对检验结果阳性的标本进行复检，以消除类风湿因子干扰。1.2.2 治疗方法A组孕妇使用泰利霉素进行治疗，口服泰利霉素400mg/次，一日一次，共服用7天，服用过程中监测肝功状态，出现肝功异常时立刻停药，并给予对症治疗。B组和C组不予特殊处理，于第7天对三组患者行后穹窿穿刺，取得的腹腔积液进行巨噬细胞分离纯化并培养。1.2.3 测量方法对巨噬细胞进行体外培养和分离纯化，将抽取的腹腔液离心后在重新悬浮沉淀物继续离心，制成细胞悬液计数后确定细胞活力90%，悬液浓度为1106/ml，铺于六孔培养板上，细胞铺板后将培养板放入37恒温培养箱中培养4h左右。巨噬细胞完全贴壁后除去未贴壁细胞重新加入培养液继续培养。将贴壁的巨噬细胞进行Giemsa染色后用显微镜观察。TNF-、IFN-，IL-4测定采用ELISA法，将巨噬细胞悬液离心后取上清液，采用ELISA检测试剂盒（法国D iaclone 公司），严格按试剂盒操作说明书进行。标准品、样品、对照孔均做复孔重复检测，经全自动酶标仪（美国 Biotek 公司）测定吸光度值，绘制标准曲线测定TNF-、IFN-，IL-4含量。用流式细胞技术测定巨噬细胞极化程度，用0.2%胰蛋白酶刺激巨噬细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后重新悬浮沉淀，加入标记的F4/80抗体和CD16/ 32抗体，用流式细胞仪（EPIC S-XL型, 美国C outer公司产品）检测细胞表面抗体的表达，室温下孵育后用双重免疫化染色技术染色，在显微镜下观察分析，CD16/ 32表达较多的为M1亚型，F4/80表达较多的为M2表型。1.3 观察指标记录A组服药过程中出现不良反应情况，观察对比三组腹腔巨噬细胞培养上清液中TNF-、IFN-，IL-4的浓度和巨噬细胞M1期细胞与M2期数，计算M1/M2，对所有孕妇进行随访，记录自然流产、死胎死产、出生缺陷等不良妊娠结局数量及发生率。1.4 统计学方法数据处理采用SPSS 22.0软件分析；计量资料以均数标准差（s）表示，组间比较采用单因素方差分析，并使用SNK法进行多样本中两两比较(q检验)；计数资料以例（%）表示，组间比较采用2分析；P0.05，见表1）表1：患者一般信息情况组别 例数（n）年龄（岁）年龄分布（例）体重指数（kg/m2）孕期（周）20252630313535岁以上A组3925.123.5717164222.33.611.31.2B组4224.894.241917331.4C组3025.033.82131421.6F值/2值2.031.281.691.33P0.050.050.050.052.2 TNF-、IFN-，IL-4的浓度及M1/M2比值 与C组相比，A、B两组TNF-、IFN-，IL-4水平均明显升高（P0.05），但与B组相比A组TNF-、IFN-，IL-4水平均明显较低，差异具有统计学意义（P0.05），说明在泰利霉素作用下活化巨噬细胞水平降低。流式细胞仪检测结果显示与C组相比A、B两组M1/M2比值明显较大（P0.05），且B组出现比例倒置现象；而与A组与B组相比M1/M2比值明显较小（P0.05），表明泰利霉素对巨噬细胞亚型分型的影响。表2： 三组孕妇穿刺液中TNF-、IFN-，IL-4的浓度及M1/M2结果组别 TNF-( pg/ml)IFN-( pg/ml)IL-4( pg/ml)M1/M2A组9.650.77*#5.720.24*#7.910.74*#0.920.15*#B组14.921.21*7.930.44*13.871.96*2.510.13*C组4.966.581.340.350.04注：*P0.05 vs C组；#P0.05 vs B组2.3各组妊娠不良结局情况 与C组相比，A组、B组合计不良妊娠结局发生率均明显较高，差异具有统计学意义（P0.05），B组的自然流产、死胎死产、出生缺陷发生率均较C组高，差异具有统计学意义（P0.05）。表3：各组不良妊娠结局组别 例数（n）自然流产死胎死产出生缺陷合计n%n%n%n%A组3925.13%12.56%410.26%7*#17.95%B组426*14.29%4*9.52%7*16.67%17*40.48%C组5012.00%00.00%12.00%24.00%注：*P0.05 vs C组；#P0.05 vs B组2.4 A组服药过程中不良反应情况本研究中A组39例孕妇在服药过程中共出现轻度药疹1例，肝功异常1例，不良反应发生率5.13%（2/39）；发现不良反应后给予立即停药对症治疗处理，治疗后症状均得以缓解，继续妊娠，随访得知两例孕妇均足月产下健康婴儿。3 讨论刚地弓形虫是一种人畜共患的机会致病性原虫，近年来有逐渐上升的趋势，育龄妊娠期妇女感染率较高且易导致不良妊娠结局如流产、早产、畸胎、死胎等1。妊娠期妇女如不及时治疗甚至可以通过胎盘进行母婴传播感染新生儿，引起先天性弓形虫病影响新生儿的神经系统等。妊娠期妇女对弓形虫的易感性和产生的不良妊娠结局与妊娠期机体免疫系统的变化有着密切关系2。参与弓形虫免疫过程的免疫细胞包括T细胞，巨噬细胞，NK细胞等以及多种免疫细胞因子。其中巨噬细胞起到重要的作用，其一巨噬细胞是弓形虫主要寄生和繁殖的宿主细胞，可以通过吞噬和溶菌机制消灭胞内寄生虫3；其二巨噬细胞可以产生多种免疫活性因子如 IL -2、 I FN -和TNF-等杀伤胞外弓形虫4。巨噬细胞按其产生的细胞因子不同可分为M1和M2两个亚型，前者主要产生IL-2和TNF-等，后者主要产生TGF-等。M1亚型作为宿主防御细胞主要发挥抗炎杀菌作用，M2亚型主要发挥组织修复作用5。由于妊娠期对胎儿的免疫保护机制，防止机体对胎儿产生自身免疫排斥反应，由M1介导的免疫系统处于抑制状态，而以M2亚型为主体的免疫系统持续存在于整个妊娠期间6。M1被抑制后会导致机体细胞免疫功能下降，会提高母体对弓形虫的易感性，弓形虫感染后刺激M1亚群增殖，影响胎儿生长发育从而导致流产等不良妊娠结局7。 泰利霉素为第三代大环内酯类抗生素，主要是通过直接与细菌核糖体的50s亚基结合，抑制蛋白质的合成并阻抑其翻译和转录8。泰利霉素已被证实适用于妊娠期妇女弓形虫感染的治疗，能进入感染组织和巨噬细胞内，杀死弓形虫包囊和滋养体9。泰利霉素口服后起效迅速，维持时间长，对弓形虫杀伤力高于其他大环内酯类药物，不良反应较少，具有用药安全性等优势，是治疗妊娠期弓形虫感染有效的药物。实验结果显示，服用泰利霉素的弓形虫感染患者用药后TNF-、IFN-，IL-4水平降低，表明泰利霉素使巨噬细胞活化水平降低，可能与泰利霉素有效杀死虫体降低弓形虫在体内的数量有关；用药后患者体内巨噬细胞M1/M2比值降低，表明泰利霉素可以影响巨噬细胞亚型分化，使M1分化程度降低；与正常人相比，感染弓形虫妊娠期患者不良妊娠结局发生率较高，用药后患者自然流产、死胎死产等发生率降低，可能与M1亚型巨噬细胞分化降低，减少对胎儿刺激，保护妊娠期胎盘微环境有关。本研究中泰利霉素不良反应较少，进一步证实其对孕妇感染治疗中的应用前景。综上所述， 泰利霉素可以提高弓形虫感染妊娠期患者的疗效，安全性较高，且可以通过改变巨噬细胞亚群分化方向来减少妊娠不良结局的发生，具有重要临床价值。参考文献1Kong L,Zhang Q,Chao J,et al.Polarization of macrophages induced byToxoplasma gondiiand its impact on abnormal pregnancy in ratsJ.Acta Trop,2015,143:1-7.2Fu X,Wu B,Huang B,et al.The correlation of Tim-3 and IFN- expressions in mice infected withToxoplasma gondiiduringgestationJ.Parasitol Res,2015 ,114(1):125-32.3张淑芳,宋任浩.异常妊娠结局妇女弓形虫感染状况J.中国血吸虫病防治杂志,2014,04:437-438+452.4Ortiz-Alegra LB,Caballero-Ortega H,Caedo-Solares I,et al.Congenital toxoplasmosis: candidate host immune genes relevant for vertical transmission and pathogenesisJ.Genes Immun,2010 ,11(5):363-73.5李雪兰,魏海霞,彭鸿娟.弓形虫感染与不良妊娠结局关系的Meta分析A.中华预防医学会医学寄生虫分会、广东省寄生虫学会.2013年全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集C.中华预防医学会医学寄生虫分会、广东省寄生虫学会:,2013:1.6Walwyn O,Skariah S,Lynch B,et al.Forward genetics screens usingmacrop