液质联用技术在药物杂质结构分析中的应用.doc

液质联用技术在药物杂质结构分析中的应用吡格列酮杂质结构分析(雍 春310011)摘要 目的：要求对吡格列酮4.800min杂质-A（相对保留时间为RRT=0.55）和7.550min（相对保留时间为RRT=0.87）杂质-B进行研究，确定其结构。方法：通过对杂质的提取提高杂质的含量，通过液质联用技术对杂质进行结构分析。结果：成功地确认了多个研究杂质的结构。关键词： 杂质 提取 液质联用技术 结构分析在药物质量研究中，有机杂质的研究成为制约药物深入研究的重点及难点。随着液质联用技术的广泛应用，液质联用技术越来越成为药物杂质结构研究的有力手段。本文通过对杂质一系列的有效提取，提高了杂质的含量，同时提高了其在质谱多级裂解中的响应，并通过液质联用技术成功地确认了多个研究杂质的结构。一、 杂质研究目的要求要求对吡格列酮4.800min杂质-A（相对保留时间为RRT=0.55）和7.550min（相对保留时间为RRT=0.87）杂质-B进行研究，确定其结构。（附 图 1）二、 仪器及试药 仪器：Agilent1100高效液相色谱仪，质谱仪，旋转蒸发仪试药：乙醇（分析纯），正己烷（分析纯），正丁醇（分析纯），醋酸（分析纯），乙腈（色谱纯），氨水（分析纯），水（重蒸水）。三、 杂质的提取吡格列酮氢化母液（附 图2） 吡格列酮 滤液（含4.6min杂质A约3.6%） 二氧六环母液样品 下层液杂质-D提取液 正己烷层（上层）含6.9min杂质-D可高达54%（附 图3）稠状物上层为有色层（有机层）收集下层水层杂质-A提取液 4.6min杂质-A含量可达约30%。（附 图4）四、 杂质的结构分析分析色谱条件1：色谱柱：依利特Hypersil ODS2 2504.6mm 5m流动相：乙腈-水-醋酸=500：500：1.2（用氨试液调节pH6.0）分析色谱条件2：色谱柱：依利特Hypersil ODS2 2504.6mm 5m流动相：乙腈-水-醋酸=420：580：0.9（用氨试液调节pH6.2） LC-MS分析色谱柱均为依利特Hypersil ODS2 2504.6mm 5m1、 峰位的确认及分子量初步分析(LC-MS分析)：取吡格列酮样品分别于色谱条件1 和色谱条件2下进样分析，并取吡格列酮样品于色谱条件2下进行LC-MS分析。结果见下表1。 表1 杂质的出峰位置的确认及分子量初步分析(LC-MS分析)色谱条件成分保留时间(RT)相对保留时间(RRT)分子量色谱条件1(附图5)杂质A4.669min0.57/杂质B7.177 min0.88/色谱条件2(附图6)杂质A6.734min0.45/杂质B12.432min0.84/色谱条件2LC-MS (图7)杂质A6.296min0.45298杂质B11.563 min0.833262、 母液的LC-MS分析：取吡格列酮母液于色谱条件1下进行色谱分析，在梯度条件下进行LC-MS分析，结果见下表2。 表2 母液的色谱分析和LC-MS分析色谱条件成分保留时间(RT)相对保留时间(RRT)分子量色谱条件1(附图2)杂质A4.694min0.56/杂质B7.276min0.87杂质D7.507min0.90LC-MS分析（梯度洗脱）(附图8)杂质A7.186min0.56298杂质B13.143min1.03326杂质E8.283min0.65257杂质D11.677 min0.91135 由于LC-MS色谱系统的变化(如调节流动相pH误差较大)会使出峰时间顺序发生变化，这在吡格列酮分析方法学研究中得到证实，所以LC-MS中分子量为326保留时间为13.143 min的杂质应为图2中7.276 min杂质B。3、 样品及杂质LC-MS/MS分析：（1） 对吡格列酮050602批样品的分析：取吡格列酮050602批样品于色谱条件1下进行液相色谱分析，并进行LC-MS/MS分析，结果见下表3。表3 吡格列酮050602批样品的色谱分析和LC-MS/MS分析色谱条件成分保留时间(RT)相对保留时间(RRT)分子量色谱条件1(附图9)杂质A4.688min0.56杂质B7.268min0.87杂质E6.720min0.81LC-MS分析(流动相为乙腈-水-冰乙酸=450：550：1.2(用氨试液调节pH6.0)(附图10)杂质A6.081min0.62298杂质B主峰后/326杂质E7.038min0.72257根据样品图中三个主要杂质相对应，并结合前面分析可以推测出图10中7.038min质量数为257杂质即为图9中6.720min RRT=0.8072杂质E；图10中主峰后质量数为326杂质即为图9中7.268min杂质B。7.038 min杂质E，其分子量为257，其结构可能为醚化物醛基氢化成为羟基的化合物。C16H19NO2 M=257（2） 对分子量为298的杂质A提取液的LC-MS/MS分析：取杂质A提取液进行LC-MS/MS分析并与盐酸吡格列酮的LC-MS/MS谱图和盐酸吡格列酮26 min色谱制备杂质的LC-MS/MS/MS比较，结果见下表4。表5 分子量为298的杂质A提取液的LC-MS/MS分析成分保留时间(RT)相对保留时间(RRT)分子量一级电离m/z二级电离m/z三级电离m/z杂质A6.071min(附图11)0.62298299.0118.9、133.9、239.8、281.8/盐酸吡格列酮(附图14)356357.2119.2、134.1、240、241.1、286.1/盐酸吡格列酮后峰色谱制备杂质(附图15)489490.4357.3119.3、134.2、177.1、250.1根据对分子量为298的杂质A进行的LC-MS/MS分析(附 图11)，与盐酸吡格列酮(附 图14)含有共同的m/z118.9、m/z134、m/z240碎片离子峰，这与盐酸吡格列酮及其后峰色谱制备杂质的裂解(附 图15)一致，都有m/z118.9、m/z134碎片离子峰，证明有极为相似的结构，由于m/z134碎片离子中含有一个N原子，分子量为偶数，根据氮规则不可能只含一个N原子，应该至少还含有一个N原子；又根据m/z281.8的碎片离子峰的裂解，丢失碎片推测可能是含一个氨基。根据吡格列酮结构与氢化工艺的分析，其可能结构为吡格列酮氢化脱去硫和羰基后的产物， C18H22N2O2 M=298其可能裂解如下： m/z118.9碎片离子可能为氢重排后的碎片离子。（3） 对母液中RRT=0.9023杂质-D提取液的LC-MS/MS分析：取杂质-D提取液进行LC-MS/MS分析，结果见下表5。 表5 杂质-D提取液的LC-MS/MS分析（附图12、图13）成分保留时间(RT)分子量一级电离m/z二级电离m/z杂质B9.329min326327.0133.9、281.0、282、298.9杂质-D9.835min135135.9120.8、346.8、525.6据对母液中RRT=0.9023杂质-D提取液的LC-MS/MS分析，该杂质-D分子量为135， M+H=135.9，有可能为2，5-二乙基吡啶，裂解可丢失一个甲基自由基，得到M+H+=120.8的碎片离子，裂解后可能形成聚合物而得到m/z346.8、m/z525.6的碎片离子。结构可能为 C9H13N M=135 可能由于裂解过程中形成自由基而发生聚合(附 图13)。表6 杂质-B的峰位置确认色谱条件样品来源附图保留时间(RT)相对吡格列酮保留时间(RRT)相对杂质-D保留时间(RRT)色谱条件1目标样图图17.550min0.87/色谱条件1母液图27.276min0.870.97色谱条件1杂质-D提取液图36.602 min0.890.96LC-MS/MS杂质-D提取液图129.392 min/0.96根据其9.329 min杂质-B的LC-MS/MS分析，可以确认该杂质即为目标样图1中所需研究相对保留时间(RRT)为0.87的杂质，其分子量为326，其裂解与分子量为298的杂质A极为相似，有共同的碎片离子峰m/z133.9、m/z282、m/z298.9再根据吡格列酮与其氢化工艺的分析，推测其结构可能为吡格列酮氢化脱硫化合物。 C19H22N2O3 M=326 附： 吡格列酮结构如下： 吡格列酮26min杂质结构如下：五、盐酸吡格列酮合成工艺路线： 根据工艺分析，结合盐酸吡格列酮合成技术人员的分析，在合成工艺氢化反应中中是有可能产生杂质A和杂质B的。六、4.6 min（RRT=0.56）杂质详细可能裂解过程分析：(1) (2) (3) 根据4.6min杂质A的裂解途径分析，杂质A的分析结构是有合理性。 裂解途径以（1）、（2）占优势，裂解途径（3）几率很小，几乎不可能。七、结论： 1、样品中杂质： 根据分析吡格列酮中4.69min（RRT=0.56）杂质A结构为 C18H22N2O2 M=298 7.27 min（RRT=0.87）杂质B结构为 C19H22N2O3 M=326 2、母液中杂质：样品及母液中6.7 min（RRT=0.81）杂质E结构为 C16H19NO2 M=257 母液中7.51min（RRT=0.90）杂质D结构为 C9H13N M=135八、讨论（1）本文选择了适当的溶剂有效地对复杂成分母液样品进行了提取，大大提高了杂质的含量，有利于杂质的研究；（2）本文对杂质进行了多级裂解，并对裂解过程进行了详尽的分析，确证了其结构；（3）本文结合了合成工艺路线的分析，证实了合成反应过程中生成该杂质的可能；（4）本文利用液质联用技术成功地对多个杂质成分进行了分析。参考文献 1、汪正范、杨树民等色谱联用技术北京，化学工业出版社，2001 2、于世林、李寅蔚波谱分析重庆大学出版社，1999 3、盛龙生、何丽一、徐连连等药物分析北京，化学工业出版社，2004 4、王光辉、熊少祥有机质谱解析北京，化学工业出版社，2005 5、赵瑶兴、孙祥玉有机分子结构光谱鉴定北京，科学出版社，2004 6、宁永成有机化合物结构鉴定与有机波谱学北京，科学出版社，2005附：图1 杂质研究要求样图图2 母液HPLC分析图谱图3 母液中杂质-D提取液的HPLC分析图谱图4 分子量为298的杂质A提取液的HPLC分析图谱图5 吡格列酮色谱条件1的HPLC分析图谱图6 吡格列酮