慢性输卵管炎动物实验研究进展.doc

慢性输卵管炎动物实验研究进展作者：章有兄.程泾单位：浙江中医药大学2007级硕士研究生 杭州 310053 浙江省温州中山医院【关键词】 慢性输卵管炎 动物实验 综 述慢性输卵管炎是由于急性输卵管炎未能彻底治疗，或患者体质较差病程迁延所致，亦可无急性输卵管炎病史。输卵管病变占女性不孕症的25%35 %,慢性炎症是引起输卵管性不孕的主要原因1。中医古籍无慢性输卵管炎之病名，根据慢性输卵管炎的临床特点，可散见于“带下病”、“癥瘕”、“经病疼痛”、“妇人腹痛”、“不孕”等病证。1 病因病理1.1 西医病因病理1.1.1 病 因 人类生殖道常见微生物种类繁多，可分为细菌、支原体和衣原体、病毒、真菌等2。慢性输卵管炎的致病微生物相当复杂，主要有两类，一类为内源性病原体，来自原寄居于阴道内的菌群，包括需养菌及厌氧菌，主要为各种化脓菌，以厌氧链球菌、溶血性链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌等多见。另一类为外源性病原体，包括淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体，其他有绿脓杆菌、结核杆菌等。临床常见多种致病微生物的混合感染。近年的研究表明，因耐多药结核、艾滋病的增加以及对结核病控制的松懈，生殖器结核发病率有升高趋势。1.1.2 病理改变 输卵管脓肿。大部分为淋球菌感染的后遗病变，但也可为慢性炎症的急性复发或再次感染。常因输卵管开口闭锁，或管腔不同部位完全或不完全阻塞，使脓液排出发生障碍而形成潴留。因此，输卵管不同程度扩张、变粗，有时呈不规则梭形，或显示节段性肉肠样。此种输卵管常伴有卵管周围炎，并多与周围器官产生粘连。输卵管积水。当脓肿长期存在，若无急性复发时，其中脓细胞成分逐渐被溶解吸收，最终遗留澄清液体，构成输卵管积水。其病变或为输卵管全部或仅为输卵管的某一节段。外观可类似长形柱状鱼泡，或卵圆形囊肿样，直接与阔韧带或卵巢相连接，外观管壁通常薄而透明。慢性间质性输卵管炎。外观输卵管常有不同程度的增大，原因多为管壁的增厚，并非管腔扩张所致。在卵管伞端，通常见有完全或有部分的闭锁或阻塞，粘膜皱襞常向内卷入。输卵管—卵巢肿块。镜检见纤维组织增生及不规则肌纤维，其中有散在的慢性炎症细胞浸润，在周围可见残余卵巢和输卵管组织，后者可有不同的慢性炎症。此外，尚有慢性结核性输卵管炎。病理表现为输卵管增粗肥大，其伞端外翻如烟斗嘴状是输卵管结核的特有表现;也可表现为伞端封闭，管腔内充满干酪样物质;有的输卵管增粗，管壁内有结核结节;有的输卵管僵直变粗，峡部有多个结节隆起。1.2 中医病因病机 多数医家认为,输卵管炎性不孕与气血失和，瘀血阻络有关，胞络冲任瘀阻，卵管不通，不易于受精成孕。该病的形成亦与湿、热、毒关系密切，多因经期产后、胞脉空虚之时，湿、热、毒之邪乘虚而入，与败血搏结于胞络，凝滞于少腹或伤及冲任带脉使其功能失调所致。而瘀阻胞络为其病理关键。或因肝郁气滞、寒凝血瘀、痰浊瘀阻或因肾虚血瘀、气虚血瘀、气阴两虚夹瘀、肾虚肝郁瘀阻所致，而虚实夹杂为其病理特点3。尤庆华4认为，该病因邪毒内侵,留连冲任,与胞脉气血搏结而成,或病久脏腑功能失调,痰湿内生,或胞脉气血凝滞,瘀血痰湿聚积日久而成。潘义敏5提出肾精亏虚,胞脉空虚,邪热入于胞宫,与血互结,阻滞胞脉,气血不畅,壅于下焦,损伤血腑,化成脓毒。王国红6认为，慢性输卵管炎急性期大量运用抗生素以及清热解毒之品,常可导致阳气被遏或受损,阴邪内盛,或素体阳虚,或病症日久迁延,热从寒化。2 动物模型及评价根据慢性输卵管炎造模所需致炎剂将其动物模型分为以下两大类。2.1 化学致炎剂所致的动物模型 以苯酚胶浆剂7为代表,卫昊等8认为，苯酚胶浆造模的病理变化更贴近中医“血瘀”证的诊断标准,其模型复制方法更符合在中医理论指导下研究中药复方的思路。造模方法是向大鼠卵巢方向注入20%苯酚胶浆0.04ml，剔除子宫有炎症和注药有阻力的大鼠,分层关闭腹腔。吴高媛9用 0.2mol/L 盐酸宫腔注射制作大鼠子宫内膜炎模型及慢性输卵管炎模型。2.2 不同病原微生物所致的动物模型 包括特异性病原体和非特异性病原体所致动物模型。2.2.1 特异性病原体所致动物模型 衣原体、支原体等在生殖系统中的致病因素已越来越受到人们关注10。衣原体：韩建德等11通过雌性小鼠阴道内接种小鼠肺炎(MoPn)沙眼衣原体,感染后不同时间观察小鼠输卵管病变情况,并通过光镜、 免疫组化和电镜研究其病理改变。感染3周内,观察到输卵管发生急性炎症,感染 37 周,输卵管表现为慢性炎症,输卵管出现扭曲、阻塞、积水等。表明通过阴道内接种沙眼衣原体 MoPn株,可以建立稳定的沙眼衣原体生殖道感染小鼠模型，但时间相对较长。支原体：韩延华等12采用 Taylor Robinson 等13介绍的激素处理造模法,造模组小鼠注射苯甲酸雌二醇,共 4 次,间隔 1周1次,每次0.125mg,第二次注射时接种解脲支原体 8型,接种浓度为2.5×105CCU,采用消毒的小儿头皮针接于小鼠阴道,应用微量注射器注入菌液 50μL,隔 1周即第三次注射后开始检测,观察阳性率,第四次注射后进行第二次检测,检测同时接种于固体培养基观察菌落。造模第 3 周进行检测,阳性49例,阳性率 81.7%，第4周检测,60 例均呈阳性,表明造模成功。2.2.2 非特异性病原体 β溶血性链球菌。李祥云等14用β溶血性链球菌制作兔输卵管阻塞模型;大肠杆菌。李莉等15采用大肠杆菌建立慢性输卵管炎动物模型，切开小鼠下腹壁，用1ml注射器向两侧子宫角近卵巢部注入5×106大肠杆菌悬液。感染7天见输卵管上皮破坏,黏膜下充血,水肿,大量中性粒细胞浸润。15天见内膜及肌层大量中性粒细胞浸润,有巨噬细胞浸润,腺体破坏。30天输卵管壁增厚,内膜及肌层有大量炎细胞浸润,包括中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞。间质细胞减少,结构破坏。也说明慢性炎症需要的时间较长;混合菌接种法。赵广兴等16采用“混合菌接种法”(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌，按2：1：1 用无菌水稀释,浓度为30×108/ml 混合菌)。造模组大鼠因急性感染死亡5只，而正常组术后无1 只死亡。综上所述，慢性输卵管动物模型的制备：应根据不同的研究目的选择合适的动物模型，对制作输卵管炎与炎性不孕症动物模型来说,以选择相应的病原微生物来制作炎症模型更为妥当。采用临床最常见的致病微生物接种大鼠输卵管制作炎性不孕症模型,处于国内领先地位,与用化学制剂苯酚糊制作的模型相比,不但更接近临床病理所见,而且从它的研究过程来看,制作大鼠炎性不孕模型技术容易掌握,可以重复,成功率高。通过肉眼观察,光镜、电镜下的对比,分阶段观察来证明模型制作是否成功是很重要的手段。接种菌量。在输卵管内接种菌液量相对固定的条件下,菌液的浓度便决定于感染动物的细菌量。浓度过低不易感染或感染率低,浓度过高易形成败血症,造成动物死亡。因此，应该严格控制细菌菌液的浓度和注射剂量。可以制作大鼠一侧输卵管炎，从而形成与自身健侧输卵管的对比。目前还没有发现结合中医的病因和辨证分型来制作慢性输卵管炎的动物模型，有待进一步努力制作此种动物模型，以实现辨病与辨证相结合。3 动物实验研究现状及方向3.1 细胞因子IL2、IL6、TNFα与慢性输卵管炎性不孕的关系 细胞因子作为细胞间相互作用的重要信使分子已引起人们广泛关注,细胞因子的异常很可能是许多致病因素造成不孕的原因,高水平的 IL2、IL6、TNFα与子宫内膜异位症导致不孕的关系已为众多学者所关注1719。但IL2、IL6、TNFα与输卵管炎性不孕的关系亦不容忽视。IL2、IL6和TNFα主要是巨噬细胞等合成和分泌的细胞因子,具有非常广泛的生物学效应,并与人类生殖活动密切相关20。IL2、IL6是炎症反应的主要标志之一,参与慢性炎症自身发展的病理生理,促进炎症损伤和纤维化,导致输卵管慢性损伤,最终形成输卵管等局部组织粘连、促进肉芽纤维组织的生长。TNFα与输卵管损伤有关,且水平越高损伤越重，与疾病的持续状态有关。在输卵管损伤较轻时,TNFα水平较低,随着病程延长,输卵管损伤加重,引起阻塞,TNFα产生增多。TNFα与IL2、IL6共同作用还可使NK细胞活化,转变成具有细胞毒作用的淋巴因子活化的杀伤细胞,损害胎盘组织,影响妊娠18。李桂等21研究桃红通管胶囊对输卵管炎性阻塞模型大鼠血液及组织中IL 2、IL6及TNFα含量的影响，经过桃红通管胶囊等药物治疗后对IL2、IL6,TNFα含量检测研究发现,输卵管炎性阻塞模型大鼠存在输卵管局部免疫功能异常及细胞因子IL2、IL6、TNFα的过表达,认为这些细胞因子通过介导免疫和炎症反应，导致输卵管局部粘连、纤维化和免疫学异常,促进了输卵管阻塞的形成和发展。刘丽等22研究中药冲剂对输卵管炎性阻塞性不孕大鼠血清TNFα含量的影响。结果表明，TNFα参与了链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌致输卵管炎症反应,认为降低TNFα含量可能是治疗输卵管炎性不孕的机制之一。研究中应注意局部免疫功能及细胞因子IL2、IL6、TNFα在发病机制及治疗中的作用,以便利用中医药防治各种微生物感染,开展针对性免疫调节治疗,进一步寻找有效的拮抗IL2、IL6、TNFα的途径。这对于开展研究输卵管炎引起的不孕将有重要意义。3.2 Bcl2、EGFR(表皮生长因子受体)与慢性输卵管炎的关系 近年来研究发现细胞凋亡失常也参与多种疾病的发生和发展,并受许多因素的调控。研究发现致病菌不但可起宿主细胞炎性坏死,又可诱发宿主细胞凋亡。细胞凋亡是一种可由基因调控的细胞自我消亡过程,细胞凋亡调控基因从功能上可分为诱导性和抑制性两种。Bcl2属于抑制性基因，这一家族成员还包括:Bclx、 bax、bad、bak、bag1、md1和AT等。Bcl2基因产物在人体细胞中表达量与细胞寿命长短有关,Bcl2过度表达可通过抑制程序性细胞凋亡来阻碍或延迟正常细胞的分化,从而延长细胞的寿命,使细胞数目增多,增加基因突变的机会。目前认识到Bcl2能够直接抗自由基氧化,维持钙稳态,阻止线粒体释放细胞色素C,抑制凋亡蛋白酶的激活。输卵管在链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌等致病菌影响下,发生炎症反应,上皮组织中存在细胞凋亡。EGFR是一种具有酪氨酸激酶活性的膜表面传感器,普遍表达于人体的表皮细胞和基质细胞,并在多种人类恶性肿瘤中存在高表达,其所介导的信号转导效应具有多向性,包括增殖、迁移、细胞分化和内环境的稳定等,并与创伤愈合、细胞增殖和恶性肿瘤的发生、发展密切相关。所有的表皮细胞和基质细胞以及部分神经胶质细胞和平滑肌细胞均可表达EGFR。正常输卵管和炎症性输卵管上皮中均可检测到 EGFR的表达,但其表达的模式不同。正常输卵管上皮只有上皮的基底层阳性表达,其余各层均为弱阳性或阴性; 而炎症性输卵管细胞呈广泛性表达,即全层阳性高水平表达。正常输卵管中 EGFR分布与输卵管上皮分化程度有关,体外细胞培养发现，外源性生长因子能刺激输卵管上皮细胞增生移动。而炎症性输卵管上皮,特别是结合上皮表达增多,高水平表达的 EGFR 明显增强了上皮细胞对生长因子的反应性,促进它与受体结合形成复合物,这样势必影响结合上皮与输卵管上皮的增殖分化进程,促进炎症进一步加重。所以 EGFR 在输卵管炎发生发展过程中起着促进的作用。因此，抑制Bcl2 mRNA 表达及促进 EGFR mRNA 表达,是治疗输卵管炎性阻塞性不孕的重要途径。刘丽等23用中药炎克宁汤剂对大鼠输卵管阻塞性不孕模型 Bcl2及表皮生长因子受体信使核糖核酸(EGFR mRNA)表达的影响。认为解毒除湿、化瘀止痛治疗输卵管阻塞性不孕模型大鼠,能抑制输卵管细胞凋亡,可能与调节 Bcl2和EGFR mRNA蛋白表达有关。3.3 ICAM 1与慢性输卵管炎性不孕的关系 ICAM1属免疫球蛋白,又名CD54,是一种重要的细胞表面黏附因子,分布广泛,可出现在活化的淋巴细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、各种上皮细胞及成纤维细胞表面,并具有介导白细胞向炎症移动及与血管内皮细胞黏附的“滚动” 受体功能。通过白细胞激活,释放大量炎症介质,调控网络的平衡功能丧失,进一步引起微血管阻塞,阻断血流致局部缺血。因此炎症造成器官损伤的关键之一是白细胞与内皮细胞的黏附,故而“抗黏附治疗”可望成为抑制白细胞介导炎症损伤的一种重要手段。杨新鸣等24应用妍婷颗粒对输卵管炎性不孕大鼠模型ICAM1的影响，认为黏附分子的作用机制可能是黏附分子促进白细胞浸润至炎症部位,白细胞与内皮细胞牢固黏附后,内皮细胞表型和功能激活,其表达某些黏附分子和细胞因子增加,进而增加血管通透性,促进白细胞浸润至炎症部位,使炎症加重。因此,若将ICAM1作为治疗输卵管炎性不孕的检测指标,将对临床起到积极的指导作用。3.4 IFNγ与慢性输卵管炎的关系 Shcheglvitova25的研究提示，解脲支原体(UU)感染引起的输卵管性不孕可能不是由于直接的损伤,而是通过免疫反应所致。他们发现血清中γ干扰素(IFNγ)水平升高,IFNγ是引起迟发性过敏反应的最重要的细胞因子之一,其参与 UU引起的输卵管损伤的机制可能是输卵管不孕的另一主要病因。它能诱导输卵管上皮细胞膜异常表达主要组织相容性复合体类抗原,从而以组织特异性方式把自身抗原提呈给自身反应性 T 细胞,启动自身免疫,并抑制支原体的繁殖,激发细胞免疫引起组织损伤。对支原体感染和非感染细胞有毒性作用,加重输卵管组织损伤,促进其他细胞因子产生,共同发挥细胞毒性作用。综上所述，对慢性输卵管炎需作系统研究，应从微循环、血液流变学、微生物学等多方面研究而不单单是免疫系统。将慢性输卵管炎的实验研究与临床研究并举，应当是现代中医对慢性输卵管炎研究的主要内容之一。【参考文献】 1 高惠娟,蔡婕,黄荷凤，等.不孕患者输卵管炎症的处理以及后续治疗J.实用妇产科杂志,2005,21(8)：453.2 徐晨.生殖系微生物与免疫学J.人民卫生出版社,2007.124126.3 程泾.妇科疑难病现代中医诊断与治疗M.北京：人民卫生出版社,2003.865869.4 尤庆华.30 例慢性盆腔炎治疗体验J.吉林中医药,2003,23(12):1314.5 潘义敏,吴文军.除湿解毒滋肾法治疗慢性盆腔炎 85 例J.陕西中医,2003,24:(5) 389390.6 王国红.益肾温通法治疗慢性盆腔炎临床体会J.吉林中医药,2001,(6):15.7 李玲.通管汤对家兔输卵管炎的抗炎作用J.中西医结合杂志,1987,7(5):293.8 卫昊,侯建平,刘清,等.坤复康胶囊对输卵管炎症模型大鼠血液流变学的影响.现代中医药,2007,27(2):44.9 吴高媛,徐东琴,刘庆,等.CO2激光加中药对大鼠子宫内膜炎的实验观察J.上海中医药杂志,1992,(1):47.10李敏清,黄婉,黄燕清.67 例不孕症患者宫颈与输卵管、盆腔液支原体、衣原体和细菌感染检测J.广东医学,2001,22(4):318319.11韩建德,陈木开,李 斌,等.沙眼衣原体致小鼠输卵管炎的病理研究J.中山大学学报(医学科学版),2005,26 (5):520521.12韩延华,于晨芳,韩延博.消抗灵号对小鼠解脲支原体感染及感染后血清中TNFα的影响J.世界中西医结合杂志,2008,3 (3):135.13TaylorRobinson D,Furr PM.Observations on experimental colonisation of mice by ureaplasmas of human originJ.J Med Microbiol,2002,51(10):866870.14李祥云,胡晓梅,李路,等.“峻竣煎”对输卵管炎变阻塞动物模型影响的实验研究J.上海中医药杂志,1997，(10):4143.15李莉,郝秋芳.巨噬细胞分泌的效应分子在小鼠急性输卵管炎中的变化J.Chin J Crit care Med,April2000,Vol 20,NO.4.16赵广兴,王春田,马宝璋，等.大鼠输卵管炎性不孕症模型的建立J.中国比较医学杂志,2004,14(1):2326.17李斌,金福明,杨来春,等.子宫内膜异位症患者血清与腹腔液中肿瘤坏死因子α及白细胞介素2，6