低温胁迫对玉米叶片抗寒性的影响1.doc

低温胁迫对玉米叶片抗寒性的影响生科1301 郑英策（东北农业大学生命科学学院 黑龙江哈尔滨150030）摘要：对两个玉米品种（九龙、利禾）进行4低温胁迫处理12h和24h，测量其叶绿素含量、过氧化物酶活性和电导率。结果表明，随低温处理时间增加，九龙的叶绿素含量先降低后上升；利禾叶绿素含量先升高后降低；九龙过氧化氢酶活性升高；利禾过氧化氢酶活性降低；两种伤害率体现出在12h时最大，而在24h是减小的现象。实验结果显示，两种不同的玉米在低温胁迫是的反应是不同的，其具体成因还需讨论。关键词：玉米 抗寒性 低温胁迫玉米(ZeamaysL)属于禾本科玉蜀黍族玉蜀黍属玉米种，学名玉蜀黍，俗称棒子、苞米、苞谷，原产于拉丁美洲的墨西哥和秘鲁沿安第斯山麓一带。哥伦布发现美洲大陆后，在第二次归程(1499年)中，把玉米带到西班牙。随着世界航海业的发展，玉米逐渐传到了世界各地，成为最重要的粮食作物之一。玉米是喜温作物，在生长早期对低温特别敏感，品种对低温冷害所具有的抵抗性或忍耐性被称为耐寒性。玉米生长的最适宜温度3035，当温度低于10植株生长明显缓慢，68时停止生长，温度更低时细胞和组织产生不可逆的损害。芽期冷害引起出苗率降低、出苗迟缓、成苗率减少；苗期遭遇低温引起幼苗萎蔫，甚至死亡，导致巨大的产量损失121.材料与方法1.1材料：九龙，利禾两种玉米种子，由东北农业大学生命科学学院植物生理教研室提供。1.2方法1.2.1玉米幼苗的培养取九龙，利禾玉米种子各300粒左右进行消毒，用蒸馏水将玉米种子洗净，在75%乙醇中消毒15s，浸种催芽处理12h后，用蒸馏水洗三次，洗去种子表面抑制生长的物质，进行沙培，将沙子平铺在培养盘上，用喷壶浇适当的完全营养液。将种子放在沙子上，种脐向上，种子间距离适当。种子上覆盖适当的沙子，约1cm厚，保证沙子湿度适当，培养条件为20，浇完全营养液，使生长健康。当植物长出四片真叶时进行试验，低温胁迫玉米幼苗并测定其3项生理指标。1.2.2处理方法将每个品种的供试材料分为三组，一组于原处继续生长，一组移至4冰柜低温胁迫12h，另一组移至4冰柜进行低温处理24h，分别作为常温对照和低温处理处取材，测定其生理生化指标。1.2.3生理指标的测定1） 叶绿素含量测定1.称取剪好的新鲜玉米叶片0.2g，放入研钵中，加入少量石英砂与碳酸钙及8ml提取液，研磨成匀浆，室温静置35min后转到10ml离心管中，4000r/min离心5min，取上清液倒入容量瓶定容至25ml。2.测定在649nm,665nm下吸光度。3.计算：Ca=13.95*A665-6.88*A649Cb=24.96*A665-7.32*A665CT=Ca+Cb叶绿体色素含量（mg/g）=CT*V*N/W式中：CT色素浓度（mg/ml）V提取液体积（ml）N植物组织鲜重（g）W稀释倍数2）过氧化物酶活性测定1.称取0.5g叶片，剪碎，放入研钵中，加适量磷酸缓冲液（pH5.5）研磨成匀浆，将匀浆倒入离心管，4000rpm，离心10min，取上清液，定容至10ml。2.酶活性测定的反应体系包括2.9ml0.05M磷酸缓冲液；1.0ml2%H2O2；1.0ml0.05愈创木酚和0.1ml酶液。用加热煮沸5min的酶液作对照组，反应体系加入酶液后，立即于37水浴中保温15min，并加入2.0ml20%的三氯乙酸终止反应，在470nm波长下测吸光度。3.计算：过氧化物酶活性=（A470*VT）（0.01*W*VS*t）A470反应时间内吸光度变化W样品鲜重t反应时间VT提取酶液总体积Vs测定取用酶液体积3） 植物细胞质膜透性1.取0.5g叶片，剪碎。2.每瓶各加10ml去离子水，于针筒中抽去细胞间空气，水渗入细胞间隙，叶片呈半透明状，沉入水下，室温放置10min3.将各瓶充分摇匀，用电导率仪测初电导值（s1）4.将各瓶在微波炉加热30s，杀死植物组织，取出称量瓶，冷却至室温，摇匀，测最终电导值（s2）5.计算：相对电导率（L）=（S1-S0）/（S2-S0）伤害率（%）=（L1-Lck）/（1-Lck）S0蒸馏水电导率S1煮沸前电导率S2煮沸后电导率L1低温处理时叶片的相对电导率Lck对照（室温下）叶片的相对电导率2结果与分析2.1低温胁迫对叶绿素含量的影响初始数据：表一叶绿素吸光值初始数据九龙利禾叶绿素吸光值A649A665A649A6650h0.4441.0340.4391.0420.4421.0480.4391.0460.4531.0280.4441.05112h0.3330.7150.5971.3870.3190.6820.5771.3770.3460.7490.5971.39224h0.430.9460.4671.1350.4430.9490.4681.1410.4410.9650.4641.136表二叶绿素含量九龙叶绿素含量测定CA(mg/L)CB(mg/L)叶绿素含量(mg/g)0h11.264.041.9112h7.683.081.3524h10.303.881.77利禾叶绿素含量测定CA(mg/L)CB(mg/L)叶绿素含量(mg/g)0h11.563.351.8612h15.264.592.4824h12.663.312.00低温胁迫对植物光合色素含量、叶绿体亚显微结构、光合能量代谢及光合系统活性等一系列重要的生理生化过程均有明显影响。在低温处理下玉米的叶绿素含量明显下降。同时，低温冷害限制了玉米叶片生长，光合作用有效的叶片面积减小，抑制了玉米的光合作用35。在低温胁迫下，随着温度下降和低温胁迫时间延长，玉米幼苗叶片叶绿素荧光参数呈上升趋势。Feierabend等研究发现，低温导致与光合作用有关的过氧化氢酶发生光失活和可变荧光参数下降，进而抑制玉米光合作用6。Fracheboud等研究发现，低温下玉米不同耐寒品种光合速率变化的差异与其耐寒性相一致7。王迎春等研究发现，光合速率降低幅度较小的玉米品种具有较强耐寒特性8。实验数据显示，九龙玉米在低温处理12h的时候，其叶绿素含量低于0h与24h，这与伤害率结果相对应，经讨论分析，产生误差的原因应该是实验操作误差以及低温处理时，24h时的实际胁迫时间不到24h(可能小于12h)；利禾玉米，在低温处理12h的时候，其叶绿素含量最高。这与理论值不同。正常状况下，随着低温处理时间的增加，植物体叶绿素遭到破坏，其含量降低。而单从叶绿素含量分析，在受到低温胁迫后，利禾的叶绿素含量大于九龙。单在叶绿素方面利禾抗寒性强于九龙。2.2过氧化物酶活性的测定原始数据九龙利禾0h0.1010.2170.0870.22412h0.1380.1730.1300.17024h0.1310.1540.1390.158表三愈创木酚吸光度平均过氧化氢酶吸光值A470A4700h0.0940.22112h0.1340.17124h0.1350.156表四过氧化物酶活性过氧化物酶九龙活性（）利禾活性（）0h125.33294.6712h178.6722824h180208玉米在低温胁迫下细胞膜系统的损伤与自由基和活性氧引起的膜脂过氧化有关。自由基、活性氧和清除它们的酶类和非酶类物质在正常条件下维持平衡状态，但在低温冷害条件下,自由基清除系统物质的含量或活性下降，活性氧自由基明显增加，当其积累超过域值时，就会引起膜脂过氧化。膜脂过氧化物丙二醛(MDA)大量积累，造成膜透性上升，电解质外渗，导致细胞膜系统严重损伤。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)及抗坏血酸氧化酶(ASP)等抗氧化酶和抗坏血酸、谷胱甘肽等抗氧化剂构成了植物的抗氧化系统。张毅等研究表明，低温胁迫导致玉米SOD活性急剧降低，耐寒性强的品种其SOD活性下降速率较耐寒性弱的品种缓慢9。王瑞研究表明，玉米幼苗POD活性在低温胁迫的初期有所下降，在低温诱导下持续增加，并随着胁迫程度的加强，POD活性增加幅度也增大。耐寒性强的品种POD活性增加幅度小；就同一温度而言，耐寒品种下降幅度明显小于不耐寒品种10实验数据显示，利禾POD活性在开始的12h中下降了许多，而从12h到24h时下降不明显；而九龙的POD活性则一直在增加。但是从总含量上，利禾POD活性强于九龙。2.3电导仪法测细胞质膜透性初始数据九龙利禾S0=4.61电导率S1S2S1S20h35.324461.628312h93.8282127.431824h86.135879.5340表五电导率结论数据九龙利禾相对电导率L1（s/cm）伤害率L2（s/cm）伤害率0h0.1280.20512h0.32222.18%0.39223.53%24h0.23111.75%0.2232.34%表六伤害率植物细胞膜系统是冷害过程最敏感部位。细胞膜在低温下由液相转变为凝胶相，膜外形和厚度发生变化，导致细胞膜透性上升，膜酶和酶系功能改变，引起细胞代谢紊乱。低温胁迫引起细胞膜结构破坏是导致植物冷害损伤和死亡的根本原因，而膜系统修复能力是膜功能得到有效行使的关键。相关研究表明，细胞膜结构的稳定性与玉米品种的耐寒性呈正相关，耐寒性强的玉米品种膜透性增大程度较慢，而耐寒性弱的品种膜透性增大迅速，造成细胞膜严重损伤11从上图表中我们可以看出，在4的条件下，无论九龙还是利禾，其12h的伤害率高于24h的伤害率。经讨论分析，可能是在12h到24h之间，植物细胞把流失的无机盐离子重新吸收；而12h时，九龙与利禾伤害率接近，可认为两种植物在此方面上相同。3.讨论：在低温胁迫下，植物组织出现受害症状。如生长放慢，叶片失绿，电解质外渗的情况。实验表明低温胁迫使玉米幼苗叶绿素含量、过氧化物活性降低，伤害率升高。综合以上所有因素，在耐低温胁迫方面，利禾耐寒性更强。 由于实验条件（冰箱）的制冷条件存在问题，低温胁迫条件大概在10左右。实验结果与预计存在较大的偏差，这些偏差存在是因为条件原因还是植物本身在受胁迫后适应其环境、产生了恢复还有待进一步讨论。参考文献：1Rodriguez V M, Romay M C, Ordas A, et al. Evaluation of European maize germplasm under cold conditionsJ.Genet. Retour. Crop Evil , 2010,57:329-335. 2Mock J J, Mc Neill M J .Cold tolerance of maize inbred lines adapted to various latitudes in North AmericaJ.CropScience,1979,19(2):239- 242.3 张毅，顾慰连，戴俊英.低温对玉米光合作用、超氧物歧化酶活性和子粒产量的影响J.作物学报，1992，18(5)：397-400.4 Leipner J, Fracheboud Y, Stamp P. Effect of growing season on the photosynthetic apparatus and leaf antoxidative defenses in two maize genotypes of different chilling to lerance J.Environmental and Exper- imentalBotany,1999,42(2):129-139.5 KosaE, Szego D, Horvath E, et al. Effect of S-methylmethionine on the photo synthesisin maizeat different chilling temperaturesJ.Cen- tralEuropeanJournalofBiology,2011,1:75-83.6Feierabend J , Schaan C , Hertwig B . Photoinactivation of catalase oc- curs under both high-and low-temperature stress conditions and ac- companies photoinhibition of photosystem II J.Plantphysiology,1992, 100(3):1554-1561.7Fracheboud Y, Ribaut J M, Vargas M, et al .Identification of quantita- tive trait loci for cold tolerance of photosynthesis in maizeJ. J. Exp.