IFNα1b对人子宫内膜腺癌细胞系JEC增殖 的影响及机制.doc

IFN1b对人子宫内膜腺癌细胞系JEC增殖 的影响及机制【摘要】目的研究IFN1b对子宫内膜腺癌细胞系JEC增殖及细胞周期的影响。方法不同浓度的IFN1b作用24h后，通过细胞计数观察对JEC的抗增殖效应，应用流式细胞技术分析细胞周期改变和细胞周期调控因子p21，cyclin A和cyclin E的表达。结果不同浓度的IFN1b对JEC均有抗增殖作用，其中500 U/ml抗增殖作用最强。流式细胞仪（FCM）检测显示S期细胞积累，p21的表达增加和cyclin A表达减少，而cyclin E的表达增加。 结论IFN1b能够抑制子宫内膜腺癌细胞系JEC的增殖，其机理可能与 p21的表达增加和cyclin A表达减少，导致S期细胞积累有关。 【关键词】 子宫内膜腺癌细胞系JEC IFN1b P21 cyclin E cyclin A 1材料和方法 1.1材料 人子宫内膜腺癌细胞系JEC来源于临床诊断为子宫内膜腺癌期患者的腹水，由遵义医学院微生物学教研室建立培养。IFNα1b为深圳科兴生物制品有限公司产品。cyclin E、cyclin A、p21试剂盒均购自天津天象人生物有限公司。PI为美国Sigma公司产品。 1.2方法 1.2.1细胞培养 JEC置入含有10%小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RMPI1640培养液中，放在37、5%CO2的孵箱中培养。取对数生长期细胞，以1.0×105细胞/孔加入24孔培养板或培养瓶中培养24h，换成含3%小牛血清培养液的0U/ml,100U/ml,500U/ml,2000U/ml IFNα1b使用液孵育24h，进行检测。每组设3个平行孔。 1.2.2细胞计数细胞培养在24孔培养板中，经0.25%胰酶消化，冷PBS吹打成单个细胞，细胞计数板计数。 1.2.3细胞周期分析采用流式细胞仪。细胞培养在培养瓶中，经0.25%胰酶消化，冷PBS吹打成单个细胞，70%冷乙醇固定，加入50ug/ml PI染液1ml,4避光染色30min, 上机分析。 1.2.4cyclin E的检测细胞培养在培养瓶中，经0.25%胰酶消化，冷PBS吹打, 4%多聚甲醛固定20min，0.1% Triton X100孵育10min，加兔抗人cyclin E单克隆抗体37孵育2h，漂洗离心后，用山羊抗兔IgGFITC标记，4，1h，漂洗离心后，FCM检测。 1.2.5cyclin A和p21的检测细胞培养在培养瓶中，经0.25%胰酶消化，冷PBS吹打, 4%多聚甲醛固定20min，0.1% Triton X100孵育10min，加鼠抗人一抗37孵育2h，漂洗离心后，用山羊抗鼠IgGFITC标记，4，1h，漂洗离心后，FCM检测。 1.2.6试验结果以均数标准差(s）表示，SPSS11.5统计软件进行处理，显著性差异以P0.05为准。 2结果 2.1IFNα1b对JEC增殖的影响 随浓度的增加，细胞数量明显减少，在500U/ml时抗增殖作用最强。2 000 U/ml有抗增殖作用，但抗增殖能力下降,见表1。表1 IFNα1b作用24h后对JEC增殖的影响*相邻浓度比较P0.05)；500U/ml组和2 000U/ml 组G0/G1期细胞数量没有差异(P0.05)；而500U/ml组G0/G1期细胞数量少于100U/ml组，差异有显著性(P0.01),见表2。 2.3p21表达 随IFNα1b浓度增加，p21含量增加，在500U/ml表达最高，而在2 000U/ml表达水平降低，见表3。 2.4cyclin E表达 随IFNα1b浓度增加，cyclin E含量增加，在500U/ml时表达最高，而在2 000U/ml表达水平降低，见表4。表2 不同浓度IFNα1b作用24h后细胞周期各时相分布3讨论 由于不同的IFNα亚型抗癌能力有差别2，本研究探讨IFNα1b对子宫内膜腺癌细胞系JEC增殖的影响。IFNα1b在一定的范围内随浓度的增加抗增殖能力增强，呈剂量依赖性关系；超过一定范围后，随浓度继续增加，抗增殖能力下降。这与前期实验中IFNα抗增殖作用随浓度升高而增强的结果有区别1。 细胞周期是细胞增殖的基础，故我们检测IFNα1b给药后细胞周期时相分布的变化。结果显示随浓度的增加，S期细胞积累，这可能是IFNα1b抑制JEC细胞增殖主要原因。由于S期细胞积累呈剂量依赖性关系，推测随着给药时间的延长，抗增殖能力会相应增强。而500U/ml组和2 000U/ml组G0/G1期细胞数量明显低于对照组，这在IFNα对其他肿瘤的抗增殖实验中也有报道3,4。 p21是CKI家族的主要成员之一，通过抑制多种CDK的激酶活性，阻滞细胞周期各时相的转换5。本实验检测到IFNα1b在一定的范围内，p21表达增加，呈剂量依赖关系；浓度继续增加，p21表达水平下降。cyclin A在S初期表达，分裂中期迅速降解，通过激活S期CDK2激酶，磷酸化前复制复合物的元件和磷酸化Rb蛋白释放转录因子E2F，促进多种与DNA复制有关因子的表达，是S期染色体复制和细胞顺利通过S期的必要条件6。实验观察到随IFNα1b浓度增加，cyclin A含量降低，呈剂量依赖关系。p21表达增加和cyclin A表达下降，可能是IFNα1b诱导JEC细胞 S期积累的原因。 cyclin E在G1中期表达，G1晚期降解，通过激活G1期CDK2激酶，磷酸化Rb蛋白，释放转录因子E2F，促进与DNA复制有关的因子和调控细胞周期的蛋白如cyclin E，cyclin A等的表达，E2F和cyclin E通过形成正反馈，使细胞由G1期不可逆转进入S期7。故cyclin E表达水平在G1/S转换中具有重要的作用。本实验发现随IFNα1b浓度增加，cyclin E含量增加，在500U/ml表达水平最高，而在2 000U/ml表达水平降低。IFNα1b促进JEC G0/G1期细胞向S期转换，可能是cyclin E表达增加和p21表达增加复杂作用的结果。 通过上述分析我们认为IFNα1b能够抑制子宫内膜腺癌细胞系JEC的增殖，其机制可能与 p21的表达增加和cyclin A表达减少，导致S期细胞积累有关。对该领域的深入研究，尤其是探讨不同IFNα亚型对子宫内膜腺癌细胞系JEC抗增殖的区别，理想的抗癌剂量和抗癌机制，对于其临床应用治疗子宫内膜癌无疑有重要的意义。【参考文献】 1 吴中明，张逸群，刘祖林.人白细胞干扰素对子宫内膜腺癌细胞系的作用研究J.肿瘤防治杂志,1999,26（4）：241243.2Horiguchi A, Uchida A. Advanced renal cell carcinoma showing a different response to two types of interferonalphaJ.Nippon Hinyokika Gakkai Zasshi, 2004,95(1):5053.3Grebenova D, Kuzelova K, Fuchs O, et al. Interferonalpha suppresses proliferation of chronic myelogenous leukemia cells K562 by extending cell cycle Sphase without inducing apoptosisJ. Blood Cells Mol Dis, 2004,32(1):262269.4Zhou Y, Wang S, Yue BG, et al. Effects of interferon alpha on the expression of p21cip1/waf1 and cell cycle distribution in carcinoid tumorsJ. Cancer Invest, 2002,20(3):348356.5Zieske JD, Francesconi CM, Guo X. Cell cycle regulators at the ocular surfaceJ.Exp Eye Res, 2004,78(3):447456.6Yam CH, Fung TK, Poon RY. Cyclin A in cell cycle control and cancerJ.Cell Mol Life Sci, 2002 ,59(8):13171326.7Mazumder S, DuPree