农药吡虫啉对牛蛙外周血红细胞的影响.doc

农药吡虫啉对牛蛙外周血红细胞的影响生命与环境科学学院 潘海乙，南旭阳*，陈院豪，陈坤摘 要：本研究以不同浓度的农药吡虫啉溶液为染毒药物，以牛蛙为实验对象，研究了牛蛙在0.005g/L到 0.04 g/L吡虫啉溶液的胁迫下，牛蛙外周血中血红细胞数、红细胞微核率、核异常率以及总核异常率的变化。结果表明：吡虫啉对牛蛙血红细胞数、红细胞微核率、核异常率以及总核异常率均有一定的影响。吡虫啉浓度为0.04g/L时，染毒组的血红细胞数不仅低于对照组，而且达到了差异显著水平（p0.05）或差异极显著水平（p0.01）。吡虫啉浓度0.02g/L时，所有染毒组的血红细胞微核率不仅高于对照组，而且均达到了差异显著水平（p0.05）或差异极显著水平（p0.01或 p0.001）。当吡虫啉浓度0.01g/L时，所有染毒组的血红细胞核异常率及总核异常率均高于对照组，而且均达到了差异显著水平（p0.05）或差异极显著水平（p0.01或 p0.001）。 关键词：牛蛙；吡虫啉；血红细胞；微核；核异常Effect of pesticide（Imidacloprid） on the Erythrocyte of Bullfrog（Rana catesbeiana）PAN Hai-yi，NAN Xu-yang，CHEN Yuan-hao，CHEN Kun(School of Life and Environment Science, Wenzhou University, Wenzhou 325035, China) Abstract: In this study, the pesticide (imidacloprid) solution was taken as the target poison and bullfrog(Rana catesbeiana) was taken as the experimental animal. The imidacloprid concentrations were set in the range from 0.005g/L to 0.04 g/L. The effects of imidacloprid on the numbers 、micronuclei rates、nuclear anomalies rates and total nuclear anomalies rates of erythrocyte in bullfrog were studied.The results showed that the imidacloprid could affect the numbers 、micronuclei rates、nuclear anomalies rates and total nuclear anomalies rates of erythrocyte in bullfrog. When the imidacloprid was 0.04g/L, the numbers of erythrocyte in the experimental groups(treated with imidacloprid) were lower than the number of erythrocyte in the contrast group. And there were significant difference between the experimental groups and contrast group(p0.05 or p0.01) . When the imidacloprid were higher（0.02g/L）, the micronuclei rates of erythrocyte in the experimental groups were higher than in the contrast group. And the difference between the experimental groups and contrast group wre significant (p0.05，p0.01 or p0.001) . When the imidacloprid were higher（0.01g/L）, the nuclear anomalies rates and total nuclear anomalies rates of erythrocyte in the experimental groups were higher than in the contrast group too. And there wre significant difference between the experimental groups and contrast group(p0.05，p0.01 or p0.001).Key words：Bullfrog；imidacloprid；erythrocyte；micronuclei；nuclear anomaly吡虫啉（imidacloprid）是一种在农业生产中常用的、属于硝基亚甲基化合物高效内吸性杀虫剂，在我国有多种商品名称，如灭虫精、康复多、必林、一遍净和蚜虱净等 1-2。吡虫啉的化学名称为1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基咪啉-2-亚胺,是防治棉蚜等农作物的主要杀虫剂 3-4。目前对吡虫啉已有较多的研究，如段强5等研究发现用610000吡虫啉拌种，可使玉米幼苗叶片和根可溶性蛋白含量分别提高12.6%和27.9%。曾春祥6等采用微量滴度酶标板法测定了吡虫啉亚致死剂量对桃蚜乙酰胆碱酯酶(AChE)的影响，发现不同亚致死剂量吡虫啉能使桃蚜AChE的活力明显降低。谢雪梅、郑巍和王圣印 7-9等则分别研究了吡虫啉对稻飞虱的控制效果、吡虫啉水解动力学机理和西花蓟马对吡虫啉抗性机制等。但是，有关吡虫啉对牛蛙等两栖类动物血液生理指标影响的研究报道尚不多见10，而两栖类作为农田中的主要生物之一，必然会受到包括吡虫啉在内的各种农药的毒害影响。同时，由于牛蛙（Rana catesbeiana）等两栖类对包括水环境在内的环境变化极为敏感, 是一类良好的监测水环境质量的指示生物11。本研究以不同浓度的吡虫啉溶液为染毒药物，以牛蛙为实验对象，研究了0.005g/L、0.01g/L、0.02 g/L 和0.04g/L吡虫啉溶液对牛蛙外周血中血红细胞数、红细胞微核率、核异常率和总核异常率的影响，期望为环境保护、农业生产等相关产业和人类自身健康等提供理论指导。一、实验材料与方法（一）实验材料实验用牛蛙购买于浙江省温州市瓯海茶山大学城农贸市场。体重为211.3715.59g，雌雄不限。吡虫啉（imidacloprid，有效成分40%，苏州遍净植保科技有限公司生产）、BS210S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）、水族箱（玻璃缸）、血细胞计数板、显微镜（OLMPUS）和计算机等。其他各化学试剂均为国产分析纯。（二）实验方法1驯养将牛蛙放在水族箱（盛有已曝气72 h的自来水）中驯养72h后随机挑选健康的牛蛙，用纱布擦干体表、称重记录后用于实验。2染毒与采血分别配制0.005g/L、0.010g/L、0.020g/L和0.040g/L等浓度的吡虫啉溶液，每个浓度中放入10只驯养后的牛蛙。每个浓度设置三个平行组，并以蒸馏水为空白对照。取血方法：用常规方法暴露牛蛙心脏采血。3红细胞计数分别在染毒4d和8d后随机取蛙用微量吸管吸取20L蛙血加入到盛有3.98ml红细胞稀释液 12的试管中，轻摇至均匀，用小管吸取上液，滴一点到计数板上的盖玻片边缘，使血液均匀地散布于计数板的室内。将计数板放在高倍镜下计数四周四个中方格和中央1个中方格内的红细胞数，然后把5个中方格所得数据之和乘以10000即得每立方毫米原蛙血中的红细胞数。4红细胞微核率计数分别在染毒4d和8d后随机取蛙采血后将血液直接涂在洁净的载玻片上，晾干，甲醇固定5分钟，瑞氏染色3分钟，缓冲液（pH值为6.8，0.1M磷酸二氢钾溶液50ml，0.1N氢氧化钠22.4ml，用蒸馏水稀释到100ml）覆盖3分钟，冲洗，自然晾干后在OLMPUS显微镜下观察计数，每张血涂片至少计数5000个红细胞中出现的微核数，结果以千分率表示。微核的判断标准是：圆形或椭圆形，直径为主核的1/5-1/4左右13。5红细胞核异常率计数将血涂片置于OLMPUS显微镜油镜下观察、计数核异常数，结果以千分率表示。核异常包括小核、双核、无核、核质外凸、核质内凹、核质断裂、核位置明显异常等。同时记算总核异常数和总核异常率（千分率）。总核异常数（率）等于微核数（率）与核异常数（率）之和。每张血涂片至少计数5000个红细胞。(三)数据处理实验所有数据用SPSS13.0 统计软件进行统计学分析。二、结果与分析（一）吡虫啉对牛蛙外周血红细胞数的影响表1 不同组中牛蛙血红细胞数Tab1 The numbers of erythrocyte in bullfrog in different groups吡虫啉浓度（g /L）处理时间（d）牛蛙血红细胞数（个mm-3）对照组（0）421.381.051040.005422.401.251040.010421.711.181040.020419.332.43104 0.040416.844.67104*对照组（0）821.241.271040.005821.153.931040.010820.792.851040.020817.422.57104*0.040814.632.64104*注：表中血红细胞数为平均数标准差*表示处理时间相同时与对照组相比差异显著（p0.05）（LSD法）*表示处理时间相同时与对照组相比差异极显著（p0.01）（LSD法）从表1可知，在吡虫啉的胁迫下，与对照组相比，除4d最低剂量组（0.005g/L）稍有上升外，其他各药物组血红细胞数均低于对照组，并且随着吡虫啉浓度的增大，各加药组的血红细胞数均随之减少。经SPSS统计分析可知：4d吡虫啉浓度（X）与血红细胞数（Y）可拟合成方程Y4d= 23.095-161.322X（R2=0.979，P0.05），8d吡虫啉浓度（X）与血红细胞数（Y）可拟合成方程Y8d=22.151-194.870X（R2=0.961，P0.05）。但是当吡虫啉浓度达到0.020g/L（处理8d）或者吡虫啉浓度达到0.040g/L（处理4d）时，与对照组相比，各加药组牛蛙外周血红细胞数均达差异显著水平（p0.05）或极显著水平（p0.01）。 这说明吡虫啉对牛蛙的血红细胞的生成具有一定的毒害影响，但在浓度较低和处理时间较短的时候毒害影响并不大，但在较长处理时间、较高浓度的吡虫啉的胁迫下则有较大的毒害影响。（二）吡虫啉对牛蛙外周血红细胞微核率的影响表2 不同组中牛蛙血红细胞微核率Tab2 The micronuclei rates of erythrocyte in bullfrog in different groups吡虫啉浓度（g /L）处理时间（d）牛蛙红细胞微核率（）对照组（0）40.830.0160.00540.840.0180.01040.870.0130.02041.040.025*0.04041.580.226*对照组（0）80.850.0340.00580.910.0370.01081.050.032*0.02081.340.064*0.04081.970.081*注：表中血红细胞微核率为平均数标准差*表示处理时间相同时与对照组相比差异显著（p0.05）（LSD法）*表示处理时间相同时与对照组相比差异极显著（p0.01）（LSD法）*表示处理时间相同时与对照组相比差异极显著（p0.001）（LSD法） 从表2可知：所有吡虫啉组的微核率均比对照组高，而且吡虫啉浓度越高、处理时间越长，牛蛙血红细胞的微核率就越高。当处理时间为4d时，0.02g/L组与对照组相比达到了差异显著水平（p0.05），而当处理时间为8d时，0.01g/L组就已经达到差异显著水平（p0.05）。而且处理4d和8d组均在0.04g/L时中达到差异极显著水平（p0.001）。这说明吡虫啉对牛蛙的红细胞核的遗传性状产生一定的毒害影响。经SPSS统计分析可知：4d和8d的吡虫啉浓度（X）与血红细胞微核率（Y）分别可拟合成方程Y4d= 0.673+21.861X（R2=0.972，P0.05）和Y8d=0.743+28.104X（R2=0.983，P0.01），说明吡虫啉浓度（X）与血红细胞微核率（Y）间存在显著线性关系，具有一定的剂量效应。（三）吡虫啉对牛蛙外周血红细胞核异常的影响表3 不同组中牛蛙血红细胞核异常率Tab3 The nuclear anomalies rates of erythrocyte in bullfrog in different groups吡虫啉浓度（g /L）处理时间（d）牛蛙血红细胞核异常率（）对照组（0）43.490.620.00544.670.75*0.01045.200.79*0.02045.610.88*0.04047.241.53*对照组（0）83.600.740.00584.840.96*0.01086.001.34*0.02087.871.77*0.04089.341.52*注：表中血红细胞微核率为平均数标准差*表示处理时间相同时与对照组相比差异显著（p0.05）（LSD法）*表示处理时间相同时与对照组相比差异极显著（p0.001）（LSD法） 从表3可知：所有吡虫啉染毒组的核异常率均比对照组高，而且随着吡虫啉浓度的升高、处理时间的加长，牛蛙血红细胞的核异常率也随之升高。与对照组相比，所有吡虫啉染毒组的核异常率均达到差异显著水平（p0.05），而且均在0.01g/L组时达到差异极显著水平（p0.001），这说明吡虫啉能对牛蛙的红细胞核异常率产生较大的影响。经SPSS统计分析可知：当用吡虫啉胁迫牛蛙4d和8d后，其吡虫啉浓度（X）与血红细胞核异常率（Y）分别可拟合成方程Y4d= 4.346+71.165X（R2=0.987，P0.01）和Y8d =4.684+124.191X（R2=0.932，P0.05），说明吡虫啉浓度（X）与血红细胞核异常率（Y）间也存在显著线性关系，也具有一定的剂量效应。（四）吡虫啉对牛蛙外周血红细胞总核异常的影响表4 不同组中牛蛙血红细胞总核异常率Tab4 The total nuclear anomalies rates of erythrocyte in bullfrog in different groups吡虫啉浓度（g /L）处理时间（d）牛蛙血红细胞总核异常率（）对照组（0）44.320.830.00545.510.80*0.01046.070.92*0.02046.651.14*0.04048.821.05*对照组（0）84.450.960.00585.751.10*0.01087.050.97*0.02089.091.23*0.040811.241.61*注：表中血红细胞微核率为平均数标准差*表示处理时间相同时与对照组相比差异显著（p0.05）（LSD法）*表示处理时间相同时与对照组相比差异极显著（p0.001）（LSD法）从表4可知：与表3所显示的核异常率情况极为类似，所有吡虫啉染毒组的总核异常率均比对照组高，而且也随着吡虫啉浓度的升高、处理时间的加长，牛蛙血红细胞的总核异常率也随之升高。与对照组相比，所有吡虫啉染毒组的总核异常率均也达到差异显著水平（p0.05）或者差异极显著水平（p0.001）。SPSS统计分析也可得出：4d和8d吡虫啉浓度（X）与血红细胞总核异常率（Y）也可分别拟合成方程Y4d= 5.018+93.026X（R2=0.988，P0.01），和Y8d =5.427+152.296X（R2=0.962，P0.05），说明吡虫啉浓度（X）与血红细胞总核异常率（Y）间也存在显著线性关系，也说明具有一定的剂量效应。三、讨论吡虫啉具有广谱、高效、低毒等特性，所以被广泛应用于各种作物对病虫害的防治，剧晓青14等研究发现吡虫啉在鲜茶叶和土壤中的半衰期分别为1.9-2.2d和3.7-2.8d。吡虫啉是通过乙酰胆碱受体(nAchR)起作用的，它与其他一些烟碱类似物一样对某些昆虫毒性并不是很高，其产生毒害影响的关键在于能否穿透神经系统，而并不在于对受体的占领能力15。吡虫啉虽然对于许多昆虫，尤其是对于温血动物来说属于低毒农药，但是吡虫啉及其代谢产物对土壤环境的影响、以及其在生物体内的代谢途径、多次施药所引起的残留性等都有可能对环境保护和人体健康产生影响。刘惠君16等曾研究了吡虫啉及其代谢产物对土壤呼吸的影响，其研究结果表明高浓度吡虫啉对土壤呼吸的抑制作用较强。张治科17等研究发现吡虫啉2次施药后53d，甘草中的残留量为0.013 mg/kg,并得出10%吡虫啉可湿性粉剂在甘草上宜采用1次施药，且施药期距采收期的间隔时间不得少于60d等结论。张金林18等研究表明吡虫啉在苹果中的最高残留量可达0.481mg/kg。本研究结果显示，吡虫啉浓度达到0.01g/L后，就会对牛蛙的血红细胞数、红细胞微核率及核异常率等产生影响，尤其是当吡虫啉浓度达到0.04g/L时，与对照组相比，所有吡虫啉处理组的血红细胞数、红细胞微核率和核异常率等相关血液指标均达到差异极显著水平（p0.001），这说明较高浓度的吡虫啉会对牛蛙产生较大的毒害影响。再考虑到农业实际操作中吡虫啉的多次重复使用所产生的残留问题等，警示我们在使用吡虫啉时，一定要遵循少量、短期等原则，以免对环境保护、农业生产以及人类自身健康产生不利影响。（指导老师：南旭阳）参考文献：1杜春秀.吡虫啉研究概况J.海南大学学报（自然科学版），2004，22（1）：84-88.2邱 光.吡虫啉的应用及其负面效应的研究进展J.华东昆虫学报，2005，14(1):76-81.3李 菁，韩召军.棉蚜对吡虫啉抗性的初步研究J.农药学学报.2007，9(3):257-262.4史成华，徐红彪.吡虫啉的合成方法J.农药，1997，37(10):11-14.5段 强，姜兴印，鲍静，等.吡虫啉拌种对高产夏玉米幼苗生长及其保护酶活性的影响J.应用生态学报，2011，22（9）：24822486.6 曾春祥，王进军.吡虫啉亚致死剂量处理对桃蚜乙酰胆碱酯酶的时间