日粮中添加延胡索酸对奶牛生产性能及甲烷产量的影响.doc

目录第一章引言.11甲烷研究的时代背景及意义.12瘤胃中甲烷菌及甲烷的生成.22.1甲烷菌的分类及理化特性.22.2瘤胃内甲烷生成的机理.33影响反刍动物甲烷气体生成的因素.43.1饲料的营养成分.43.2饲料的处理加工与贮存方式.43.3日粮类型与采食水平.43.4瘤胃微生物对甲烷生成的影响.53.5环境温度.54降低瘤胃内甲烷生成的措施.64.1改变日粮组成及饲养水平.64.2添加电子受体或离子载体.64.3添加卤代化合物.74.4去原虫.85甲烷气体的测定方法.85.1示踪法.95.2封闭测试法.95.3估测法.105.4微气候学测试法.106问题的提出.10第二章日粮中添加不同浓度延胡索酸对奶牛生产性能影响.121材料与方法.121.1试验动物.121.2试验设计.121.3饲养管理.121.4试验牧场.131.5试验材料.132样品的采集与处理.132.1采食量的测定.132.2产奶量的测定及乳样采集.132.3饲料样的收集及处理.142.4粪样的采集及处理.142.5血样的采集及处理.143样品的分析测定.143.1乳成分的测定.143.2饲料样品和粪样的测定.143.3血液生化指标测定.174数据处理与统计分析.175结果与分析.175.1日粮中添加不同水平延胡索酸对干物质采食量、产奶量及饲料转化率的影响.175.2日粮中添加不同水平延胡索酸对养分表观消化率的影响.185.3日粮中添加不同水平的延胡索酸对奶牛乳成分的影响.195.4日粮中添加不同水平延胡索酸对奶牛血液生化指标的影响.205.5经济效益分析.216讨论.216.1日粮添加延胡索酸对奶牛生产性能的影响.216.2日粮中添加不同水平延胡索酸对养分表观消化率的影响.256.3日粮中添加不同水平延胡索酸对奶牛血液生化指标的影响.256.4泌乳中后期奶牛日粮中延胡索酸添加量的探讨.28第三章日粮中添加不同浓度延胡索酸对瘤胃甲烷产量的影响.291试验材料.292试验动物与试验设计.293日粮组成及饲养管理.294试验器材的准备与制作方法.304.1渗透管的制作.304.2牛轭及采气装置制作.324.3所需的仪器设备.335测定指标及方法.336 SF6示踪原理及计算方法.336.1示踪原理.336.2计算举例.337数据处理与统计分析.348结果与分析.349讨论.35第四章结论.37第五章有待解决的问题.38参考文献.39在读硕士期间发表的学术论文.47致谢.491第一章引言延胡索酸(fumaric acid)又称富马酸，为乙烯的反式二羧酸反丁稀二酸，是一种四碳双羧酸，分子式为HOOCCH=CHCOOH，是琥珀酸一丙酸途径的关键中间产物，作为柠檬酸循环的中间产物广泛存在于生物组织中。它的顺式为马来酸(顺丁烯二酸)。它除以钾盐的形态广泛存在于植物界(例如Fumaria officinalis)外，还可通过微生物发酵生成(延胡索酸发酵)。在好氧代谢中，它作为三羧酸循环的一环起重要作用，琥珀酸如为琥珀酸脱氨酶所氧化，便生成延胡索酸。后者在延胡索酸的作用下，加一分子H2O，就形成苹果酸。这些酶促反应是可逆的，在大多数细胞和组织的呼吸途径中，占有重要的位置。1甲烷研究的时代背景及意义近几十年来，随着改革开放和人们生活水平的不断提高，我国反刍动物养殖业蓬勃发展，据联合国粮农组织统计资料表明，我国牛羊肉产量已处世界前列，但我们也应清醒认识到我国畜产品数量迅速增长，造成温室气体的大量排放，全球气候变暖给全球自然社会和生态带来了一系列灾难性的后果。这种由于大气中二氧化碳，甲烷等微量气体浓度的增加所导致的温室效应目前受到各国的普遍重视。世界气象组织(WMO)，联合国环境规划署(UNEP)和许多国家政府纷纷组织有关科学家进行广泛研究。甲烷被认为是仅次于二氧化碳的引起全球变暖的重要气体。报道，CH4气体对气候变暖的影响占所有温室效应气体的151，甲烷是与全球气候变化密切相关的温室气体,进入大气层中的甲烷总量为4006001012g/a2，反刍动物瘤胃内生成的甲烷通过嗳气排入大气，对全球气候变暖的影响作用占到所有影响气候变暖因素作用的15%20%，其增温潜势是二氧化碳的62倍。全球反刍动物年产甲烷约7.7107吨，占散发到大气中的甲烷总量的15%，而且每年还以1%的速度递增3。研究者普遍认为甲烷的温室效应是二氧化碳的2030倍，甲烷在大气中的含量为1.7mg/kg，其浓度仅为二氧化碳的0.49%，但甲烷的红外吸收值(3.3m处有特征吸收值)远高于二氧化碳，单位体积甲烷造成的温室效应是二氧化碳的30倍。全球气候变暖问题已是国际十分关注研究重点，2009年12月7-18日在丹麦首都哥本哈根召开哥本哈根世界气候大会全称联合国气候变化框架公约第15次缔约方会议暨京都议定书第5次缔约方会议，就未来应对气候变化的全球行动签署新的协议。IPCC(2000)研究表明到2010年将由19811990年全球平均气温比100年前上升了0.48到全球年均气温将上升1.82.54，这将对人类健康及生态环境产生了极其重要的影响。我国农业部环境保护科研监测所对我国家养动物和动物废弃物甲烷排放量的估算结果是1988年为6.314Tg，其中反刍动物排放5.67Tg，占89%；1990年为6.61Tg，2其中反刍动物排放5.91Tg，占84.9%，甲烷排放量平均每年大约以2.34%的速度上升。反刍动物因产甲烷而损失的能量可占其采食饲料总能的2%15%5。Church和Pond(1982)报道反刍动物日粮中能量损失主要包括(占总能进食量的)：粪2027；甲烷710；尿23；体增热13186。反刍动物排放甲烷是动物采食的饲料在瘤胃内正常发酵所产生的，反刍动物的甲烷排放意味着能量的损失和动物生产力的降低。不同的饲喂水平，日粮组成和日粮的表观消化能对甲烷产量有不同的影响程度，通常饲料的消化率越低，单位畜产品的甲烷排放量也越大。我国由家畜散发的甲烷产量约占世界的7%10%7。因此，减少反刍动物甲烷的排放量已经成为国际上十分关注并重点研究的问题。2瘤胃中甲烷菌及甲烷的生成2.1甲烷菌的分类及理化特性产甲烷菌是瘤胃中细菌的一种，甲烷菌高度厌氧，难以培养，甚至在一些极端环境中生存，称为“伪培菌”，这是甲烷菌长期进化的结果。从系统发育看，甲烷菌分成5个目，分别为甲烷杆菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)、甲烷微菌目(Methanomicrobiales)和甲烷超高温菌目(Methanopyrales)8。1957年，Opperman首次从瘤胃中分离出甲烷菌并把其归类为到甲酸甲烷杆菌(M.formicium)9，一年后，Smith10和Hungate11两位教授又从瘤胃中分离出来新的甲烷菌，并认为他们得到的甲烷菌种其细胞菌落形态特征都不同于其他的甲烷菌，命名为反刍兽甲烷杆菌(Methanobacterium ruminantium)。目前，已有66种甲烷生成菌可从垃圾场，含硅泥的沼泽，温泉，盐湖，温湖及动物肠道等具有严格厌氧的环境中分离出来，分属3个目，6个科和13个属，而从瘤胃中分离出来的却仅有6种(见表1.1)，其中只有甲烷八叠球菌和反刍兽甲烷短杆菌在瘤胃中的数目达到1106mL-112。表1.1瘤胃内的甲烷生成菌Table 1.1 Methanogens in the rumen种类形态细胞膜组成能源反刍兽甲烷短杆菌短杆状、CoM、PS H2/甲酸甲烷短杆菌短杆状、CoM、PS H2/甲酸巴士甲烷八叠球菌团装不规则球菌，HPS+PR H2/甲醇万式甲烷八叠球菌球菌、HPS甲醇、甲胺/乙酸产甲酸甲烷杆菌长杆丝状，PS H2/甲酸运动甲烷微菌短杆，PR H2/甲酸注：CoM:辅酶M，PR:蛋白质，HPS：杂多糖，PS：假包壁质甲烷生成菌不仅是严格厌氧菌，而且只能在氧化还原电势低于-300mv的环境下才能生长，其细胞壁组成中不含肽聚糖，细胞膜内含有假胞壁质、蛋白质、糖蛋白或杂多糖，拥有一些特殊的辅酶(如辅酶M，HS-HTP，F420)和脂类细胞壁的此特性在通3透、渗透或破坏细胞质与环境之间的屏障等试验研究方面具有重要意义，青霉素、环丝氨酸和缬氨霉素等抗生素可以抑制细菌细胞壁的合成，但对甲烷菌的细胞壁不敏感。利用甲烷菌的这一特点，可以从细菌中分离得到纯甲烷菌菌株。不同种类的甲烷菌细胞壁差异很大。甲烷菌与瘤胃其他微生物之间存在着各种关系，其中，Richard等13研究了瘤胃内原虫和甲烷菌之间的特异性联系，发现甲烷杆菌科与原虫共生，甲烷微菌目(甲烷微菌科、甲烷粒菌科和甲烷螺菌科)的甲烷菌游离存在于瘤胃液中。2.2瘤胃内甲烷生成的机理产甲烷菌(Methanogens)是瘤胃内的古细菌代表之一，它们有严格厌氧性，属于自养型或混合营养型，生长缓慢，1990年，Worse14提出了Bacteria(细菌)、Archaea(古生菌、古细菌、古菌)和Eukarya(真核生物)三界学说。产甲烷菌能将H、CO2、甲醇、甲酸、甲胺、乙酸及其他化合物转化成甲烷或CO2和甲烷，从中获得能量15。在甲烷形成的过程中也伴随着细胞膜内外化学梯度的形成，这种化学梯度的形成过程类似于以氧为末端电子受体的氧化磷酸化和电子传递链的偶联16。并且在化学梯度形成过程中，Na+离子梯度的形成是通过钠离子泵-Methyl-H4MPT:HS-CoM甲基转移酶实现的，H+梯度的形成则是通过位于细胞膜上的氢化酶实现的，氢化酶催化与HTP-S-S-CoM还原偶联的氢的氧化。形成的Na+和H+梯度最终驱动位于细胞膜上的ATP合成酶产生ATP。瘤胃内甲烷菌利用氢还原CO2产生甲烷是主要途径，因此，H和CO2是甲烷菌产生甲烷的主要前体物，在瘤胃中，这两种成分主要由碳水化合物经过微生物降解产生。瘤胃微生物合成甲烷的途径主要有：(1)CO2-H2还原途径4H2+HCO3-+H+CH4+3H2O此路径是瘤胃内甲烷主要途径，瘤胃中82%的甲烷由H2和CO2的还原反应生成。CO2在一系列酶的作用下传递C1基团相继生成中间体甲酰甲烷呋喃、甲川四氢甲烷蝶呤、甲叉四氢甲烷蝶呤、甲基四氢甲烷蝶呤、甲基辅酶M，最后释放甲烷17，其中，CO2主要来自丙酮酸转变为乙酸的脱羧过程；还有一小部分来自唾液或透过瘤胃壁的HCO3-；H2主要是通过纤维素降解为丙酮酸后，丙酮酸再转变成乙酸和H2，由于H2能够迅速被产甲烷菌利用，并作为微生物活动过程中其它还原反应的氢供体，所以瘤胃内氢分压维持在适宜的水平。(2)甲酸、乙酸发酵途径少量甲烷是由甲酸，乙酸，丙酸和丁酸等VFAs形成，其中就，甲酸很容易分解产生甲烷和CO2，乙酸也可以生成甲烷，反应如下：4HCOOHCH4+3CO2+2H2OCH3COOHCH4+CO2(3)甲醇生成甲烷的途径44CH3OH3CH4+CO2+2H2O(少)CH3OH+H2CH4+H2O(少)(4)甲胺生成途径4CH3NH2Cl(甲胺)+2H2O3CH4+CO2+4NH4Cl2(CH3)2NHCl(二甲胺)+2H2O3CH4+CO2+4NH4Cl4(CH3)3NHCl(三甲胺)+6H2O9CH4+3CO2+4NH4Cl这4种途径是有一定的先后顺序的，Nelson18发现在瘤胃发酵的前期(初期)和旺盛期，主要以CO2-H2还原途径为主，而在消化后期甲烷的生成则与脂肪酸和醇等相联系的还原途径较多。3影响反刍动物甲烷气体生成的因素3.1饲料的营养成分饲料中碳水化合物的类型对甲烷产量的影响，是通过影响瘤胃pH和瘤胃菌群来实现的。含高比例的易发酵碳水化合物的发酵模式转向耗H2生成丙酸的途径19。Kreuzer等20，用玉米淀粉代替纯粗纤维的40%，能大约减少30%的甲烷释放量。细胞壁成分发酵会产生高的乙丙比和高的甲烷损失21，22，相对于碳水化合物和蛋白质，乙醚提取物能明显减少了甲烷的产量(-212gmethane/kg EE)。Czerkawski等23和Demeyer and Van Nevel等19研究表明，脂肪和包括乙醚提取物部分的其它化合物几乎不被瘤胃微生物发酵，尤其是不饱和脂肪酸已经被试验证实具有抑制甲烷菌在微生态系统中的活性，粗纤维(CF)对于甲烷产量的影响(79g CH4/kg CF)主要是由于高粗纤维日粮增强了纤维分解菌甲烷生成菌的共生关系24。3.2饲料的处理加工与贮存方式牧草的成熟阶段、贮存方式方法、化学处理和物理加工过程(如碾碎、制粒、切碎)都影响每单位可消化牧草的甲烷产量。牧草越成熟则甲烷产量就越高，而制成干草的牧草甲烷产量要比青贮高，对牧草进行粗切要比粉碎或制粒处理甲烷产量高25，这可能是碾压和制粒的加工处理提高了动物的采食量。据报道，牧草的粗制切碎比细致碾碎或制粒的牧草损失更多的甲烷能26。其原因主要是动物自由采食这些碾碎的小粒饲料加快了瘤胃内溶物流通速率，降低了微生物对细胞壁碳水化合物的消化率，缩短了消化时间，从而降低了甲烷产量。因此，当饲草具有延长饲料残渣在瘤胃中的滞留时间和降低消化率的性能时，一般来说会增加每单位可消化饲草的甲烷产量。3.3日粮类型与采食水平日粮类型影响瘤胃的发酵类型，进而影响甲烷的产量，这种影响主要是通过改变瘤胃pH和微生物区系而产生的。有试验证明，反刍动物饲喂可溶性碳水化合物或淀5粉可使瘤胃的pH降低，抑制了甲烷生成菌和瘤胃纤毛虫，并增加了丙酸产量27。当反刍动物采食或瘤胃灌注富含淀粉的日粮或一定剂量的可溶性碳水化合物如葡萄糖时，瘤胃丙酸产生量增加，甲烷产生量降低，且乙丙比也随之降低，这种瘤胃发酵模式的改变是由于瘤胃降解率提高，有利于丙酸的生成19。Moe和tyrrell28指出，碳水化合物的结构性质影响甲烷产量，饲喂可完全消化的纤维源(消化率接近100%)，如甜菜渣，甲烷损失可降低至采食量的4%5%。当给动物饲喂粗饲料时，可使纤维素分解菌大量增殖，瘤胃主要进行乙酸发酵，产生大量的氢，导致瘤胃氢分压升高。这时就会刺激产甲烷菌大量增殖，甲烷产量明显增加。Wolin and Miller29和Bonhomme30在维持水平下饲喂的日粮当添以易降解的碳水化合物(如:谷物)会使瘤胃纤毛属原虫增殖。研究发现当瘤胃发酵的乙丙酸比例为12时，不产生甲烷，即饲料的能量损失为0；当碳水化合物发酵全部生成乙酸时，以甲烷的形式损失的能量约为33%。Okine et al.31发现当动物采食量提高时，可减少甲烷的产量。提高反刍动物的采食量，甲烷损失的日粮的总能降低1.6%32，而当采食量提高到维持水平的两倍时，甲烷的总产量上升，但单位摄入能量的甲烷损失下降12%30%33。3.4瘤胃微生物对甲烷生成的影响反刍动物的瘤胃内存在着大量的严格厌氧微生物，主要是纤毛虫和细菌，每毫升瘤胃液中约含有l106个纤毛虫和l1010个细菌，它们和真菌一起将动物不易消化植物纤维降解为挥发性脂肪酸、CO2和H2，其中的CO2和H2被甲烷菌利用生成甲烷。纤毛虫的细胞膜内壁结合有多种脱氢酶，可以催化各自的底物脱氢，生成的氢分子则附着在纤毛虫上，这些氢分子能够抑制纤毛虫的大量增殖，而寄生在纤毛虫上的甲烷菌却能够利用这些氢分子与CO2结合生成甲烷，甲烷菌与纤毛虫常常大量结合在一起，因此，纤毛虫对甲烷的产生具有促进作用34。Stumm等35在绵羊的瘤胃内容物中也观察到了纤毛虫与甲烷菌的这种结合关系，Krumholz et al.36通过试验证明，纤毛虫对甲烷菌产生甲烷的有促进作用，同时还发现原虫也是瘤胃内主要的产甲烷微生物。Joblin等37证明，纤维素作为反刍动物瘤胃内细菌的主要发酵底物，在其发酵过程中产生大量的氢，甲烷菌则通过种间氢传递(Interspecis H2 transfer)将其合成甲烷，降低瘤胃氢分压，然而氢分压降低，提高纤维分解菌对纤维素的消化程度，使氢的总产量和乙酸的产量增加38，最终导致甲烷的产量增加。3.5环境温度反刍动物瘤胃中甲烷的产量受环境温度影响很大，随环境温度的降低而降低。Milligan39证明，在寒冷的环境条件下，绵羊瘤胃甲烷的产量会降低30%，这可能是由于低温而引起绵羊的采食量增大造成的。较低的环境温度，可是瘤胃的发酵类型趋于丙酸发酵，从而引起甲烷产量的降低40，而且，较低的环境温度能提高瘤胃内食糜6的后流速度，降低了甲烷的产量，有试验表明，当瘤胃的颗粒相和液相的流通速度分别提高68%和54%时，绵羊瘤胃内甲烷的总产量将降低30%39。4降低瘤胃内甲烷生成的措施4.1改变日粮组成及饲养水平瘤胃中甲烷的产生量受饲料种类、饲料水平、精粗比及供给方法的影响较大。因此，通过改善饲料供给技术及日粮组成抑制甲烷的产生是一种最现实且行之有效的方法。一般而言，喂给高纤维饲料甲烷的产量将提高，而与精饲料搭配或喂给高蛋白饲料则甲烷产量将下降。精饲料的种类也影响甲烷的生成，这是因为饲料在瘤胃内的消化性因其种类不同而区别。日粮类型影响反刍动物瘤胃中甲烷的生成，当动物自由采食高精日粮时，以甲烷形式损失的能量占饲料总能的2%3%，而动物自由采食草料(维持水平)时其能量则能量损失可达6%7%41。其原因可能是高精日粮或日粮中添加可溶性碳水化合物使瘤胃的发酵模式发生变化，趋向丙酸发酵，瘤胃流通速度加快，pH降低，不利于产甲烷菌的生长。在日粮中添加脂肪酸和脂肪也可以抑制甲烷的生成，同时也改变了瘤胃中VFAs的比例，改善生产性能和泌乳效率。中链脂肪酸(MCFA)可以抑制甲烷菌以及甲烷的生成，Dohme et al.42用不同的非脂化的中链脂肪酸(8:0，10:0，12:0，14:0)作比较后，结果发现12:0和14:0两种中链脂肪酸对抑制瘤胃甲烷和甲烷产量都最为有效。但是，中链脂肪酸对甲烷生成的抑制程度也受基础日粮的影响43,44。饲喂不同种类牧草甲烷产生量不同的原因与植物中含有的化学物质有关，如不同种植物中单宁和皂角苷含量是不同的。还有研究发现牧草质量也影响单位增重或单位体重的甲烷产量。McCaughey等45发现肉牛饲喂干草和苜蓿的混合物以甲烷形式损失的能量占采食总能的7.1%；而当单独饲喂干草时，则损失占总能的比例为9.5%。Waghorn等46通过对比试验证明，饲喂绵羊不同种类牧草时，甲烷产生量差异显著：采食白苜蓿和黑麦草时甲烷产生量最多，为25.7g/kgDM;而采食百脉根属植物时为11.5g/kg DM。McCaughey45通过饲喂高质量的牧草与劣质牧草，结果表明饲喂高质量牧草甲烷产生量降低20%。4.2添加电子受体或离子载体降低瘤胃中甲烷的生成可以通过增加利用氢气和甲酸的微生物来实现。瘤胃中存在数种细菌可以利用氢气或甲酸，可以通过添加这些细菌利用电子受体来降低甲烷产量。如瘤胃中的产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、产乳酸月形单胞菌(Selenomonas ruminantium ssp.Lactilytica)、产琥珀酸沃林氏菌(Wollinellasuccinogenes)、小韦荣菌(Veillonella parvula)和反刍月形单胞菌反刍亚种(Selenomonas7ruminantium ssp.Ruminantium)均可与甲烷菌竞争利用氢气，它们利用延胡索酸作为电子受体氧化氢气。其中，产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、产琥珀酸沃林氏菌(Wollinella succinogenes)、小韦荣菌(Veillonella parvula)可以利用甲酸做底物生成甲烷，甲酸作为还原延胡索酸的电子供体。这些细菌对甲酸的亲和力远高于甲烷菌。当甲烷菌与延胡索酸利用菌等量培养时，甲酸和氢气生成甲烷的量降低。Asanuma等47通过体外研究发现，补饲延胡索酸可以降低甲烷的生成，增加瘤胃内丙酸的产量。Itabashi48试验结果表明，添加延胡索酸能在不影响纤维消化的情况下有效地抑制甲烷生成。研究还发现，对于减少甲烷合成，延胡索酸是最有效的49，Takahashi等指出，在微生物体外发酵中延胡索酸可以作为电子受体，尽管他们没有说明减少甲烷的产量50，但延胡索酸作为丙酸合成的中间物，而丙酸又是一种糖异生物质，对家畜有重要的营养作用。添加氢气竞争性受体，如不饱和脂肪酸或硝酸盐与半胱氨酸的混合物、硝酸盐等，与产甲烷菌竞争氢气以抑制甲烷菌的生长。Takahashi等50发现当粗饲料作物中含有硝酸盐时能显著降低甲烷产量，但硝酸盐还原过程中产生的中间产物亚硝酸盐对瘤胃微生物和动物都有毒性，限制了硝酸盐作为甲烷抑制剂的使用。2005年，Sar等51在一项体外试验中意外的发现一种野生型的大肠杆菌(E.coli W3110)有降低亚硝酸盐的毒性的功能，并使甲烷产量减少了27%，该项研究有可能使人们重新对廉价的硝酸盐作为甲烷抑制剂产生兴趣。添加离子载体也可以降低甲烷的产量，如日粮中添加莫能菌素，不但可直接抑制甲烷生成菌，而且还抑制生成氢和甲酸细菌的活性，同时能抑制甲酸脱氢酶的活性52，从而减少了甲烷产生所需的氢源，使甲烷产量降低，增强形成琥珀酸和丙酸的细菌活性，结果使丙酸含量增加。有研究表明，用莫能菌素饲喂肉牛时，在低纤维饲料中甲烷产量下降16%，而高纤维饲料中则可以下降24%，通过饲喂莫能菌素不仅降低甲烷产量及增加瘤胃中丙酸含量，而且提高饲料利用效率53。4.3添加卤代化合物甲烷卤化物及类似化合物如氯化的脂肪酸、三氯乙炔、嗅氯甲烷等，可以直接抑制甲烷的生成，这些化合物对甲烷生成菌有毒害作用，可抑制20%80%的甲烷产生，但是卤代化合物挥发性强，在实践中很难操作，不能作为饲料添加剂直接使用。McCrbab etal54将a-环糊精和嗅氯甲醛的混合来抑制甲烷，降低了卤代化合物的挥发性。1995年，May etal.55报道，添加a-环式糊精和嗅氯甲烷的复合物可以长时间抑制牛羊瘤胃内甲烷的生成。但有些瘤胃微生物在一定程度上也会对其进行降解或适应，导致对甲烷抑制的效果并不十分明显。据Rusell56报道，氯仿可以完全抑制甲烷的产生，是因为氯仿能够抑制CH2-VB12中的甲基转移到合成甲烷所必须的甲基辅酶M(CH3-CoM)中，甲基辅酶M是甲烷合成过程中甲酰-S-CoM的底物。2-嗅乙烷磺酸钠(BES)也是一种很有效的CH4抑制剂，它是一种甲烷生成时与甲基转移有关的辅酶F的嗅化物。BES是具有特异性的抑制剂，仅对甲烷菌有抑制作8用，不会抑制其它细菌的生长。通过体内试验发现其抑制甲烷生成的效果短暂，可能甲烷菌对BES产生耐性57。4.4去原虫反刍动物瘤胃内原虫代谢碳水化合物过程中，可产生大量的氢。而产甲烷菌或黏附在原虫表面35或存在于原虫内部58将氢转化成甲烷。H2和CO2都是原虫生长的限制性因素，原虫代谢产生的H2可以通过吸附作用转运至菌体内，产甲烷菌就可以利用H2与CO2产生甲烷，产甲烷菌与原虫协同生长。驱原虫后，产甲烷菌没有吸附物，并且氢源减少，这样甲烷的产量就下降，同时也减少发酵造成的能量损失。大量试验研究表明大约有20%的甲烷产生菌寄生在原虫表面，并且带有纤毛的原虫能与甲烷产生菌形成内源的共生系统。一些报道指出，寄生在原虫表面的甲烷菌的产生甲烷的量可占反刍动物甲烷总排放量的37%，驱除原虫也就间接减少了甲烷菌数量，因此能显著的降低反刍动物甲烷的排放量。通常采用的去原虫方式有四种：1)化学药品：1930年，Becker等首次用硫酸铜驱除原虫，之后，硫代琥珀酸二辛基钠盐、过氧化钙和去污剂相继被用来驱除原虫。这些药品主要是通过改变原虫表面张力而使其破裂，但是驱虫的效果取决于驱虫过程中的停饲处理，对正常采食的动物体内的原虫没有作用59。反刍动物日粮中添加硫酸锌驱除原虫可显著降低甲烷产量，但纤维的消化率也随之降低60。2)改变日粮组成：原虫不耐酸，瘤胃的低pH可使原虫死亡，可以突然延长或换成全谷物日粮来降低瘤胃pH，以达到驱虫的目的。此外，C18不饱和脂肪酸、乳脂、植物油等对原虫也具有毒性，因此也可用来驱除原虫。McGinn等61试验表明，在肉牛日粮中添加400g/d的葵花籽油，甲烷的排放量可减少了22%，总能的损失可减少了21%。3)生物学制剂：主要是瘤胃原虫中存在外来侵染性生物，利用这些生物如壶纲真菌、原虫病毒及立克次氏体样生物来控制瘤胃原虫的数量62；传统的一些生物制剂如米曲霉、啤酒酵母等尽管可以减少原虫数量，但有时甲烷产量与原虫数量不一致。4)天然化合物：许多天然化合物，如单宁、蜕皮激素、皂甙、维生素A、非蛋白性氨基酸及其类似物都有去原虫作用并已作为除原虫试剂被使用。Newbold等63发现一种热带饲料树的叶子具有抗原虫作用；植