以减毒沙门氏菌呈递的生长抑素基因疫苗免疫母鼠的生物.doc

华中农业大学本科毕业论文（或设计）目 录摘 要I关键字：IIAbstractIIKey word:III1前言12材料和方法22.1 材料22.1.1免疫用基因疫苗22.1.2试验用小鼠22.1.3试验用仪器22.1.4主要试剂22.1.5主要试剂的配制22.2 试验方法32.2.1 重组沙门氏菌中质粒的提取及鉴定32.2.2 疫苗准备32.2.3 试验动物免疫方法32.2.4 试验动物的饲养及管理32.2.5 组织样的采集和处理32.2.6 基因组DNA的质量检测及内参照PCR42.2.7 PCR方法的敏感性和基因整合可能性的分析:43 结果与分析53.1 重组质粒pGM-CSF/SS的酶切鉴定53.2PCR敏感度检测53.3母鼠及仔鼠基因组DNA质量检测63.母鼠及仔鼠基因整合检查74 讨论84.1 关于免疫组各组细胞基因组DNA的提取分析94.2 关于PCR敏感性分析94.3 关于pGM-CSF/SS基因整合的可能性分析95 结论10参考文献10致 谢12以减毒沙门氏菌呈递的生长抑素基因疫苗免疫母鼠的生物 安全性研究 摘 要 DNA疫苗的生物安全性是其走向临床前所须解决的关键问题之一。将以减毒沙门氏菌呈递的pGM-CSF/SS DNA疫苗免疫母鼠,验证其对母鼠的安全性,为临床应用提供安全性证据。将45只5周龄昆明小白鼠随机分为3组,分别用pGM-CSF/SS（A组）、减毒沙门氏菌空菌（K组）、PBS（C组）口服免疫,剂量为200L, 浓度为2 1010 cfu/ mL.进行免疫后,待母鼠产仔后3周提取母鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、生殖各组织DNA，提取仔鼠3、6、9周仔鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、生殖各组织DNA,利用PCR技术来检验母鼠和仔鼠各组织基因整合的可能性。结果显示：pGM-CSF/SS DNA疫苗免疫母鼠后，使用引物扩增和凝胶电泳检测母仔鼠各组织基因组,其发生基因整合的频率（2.310-8）远远低于基因自发突变的频率（210-6），）。因此认为，pGM-CSF/SS DNA疫苗不会随机插入到宿主基因组中，具有较高的生物安全性。关键字： 生长抑素； DNA疫苗； 生物安全性； 基因组整合 Evaluation on the biosafety of pGM-CSF/SS Somatostatin Dalivered by Attenuated Salmonella in Female-miceAbstractThe biosafety of DNA vaccine is one of the key questions problems which should be solved before it is used in the clinical trail. ToIn order to study the Evaluation evaluate on the biosafety of pGM-CSF/SS somatostatin delivered by attenuated salmonella in female-mice, In order to evaluate the biosafety when it is used in the clinical trail. 45 female mice at the age of 5 weeks were selected and divided randomly into 3 groups. Mice were orally administered with pGM-CSF /SS plasmid (A)、attenuated Salmonel l a. (K)、and PBS(C)with the dosages of every groups were 2 1010 cf u/ mL, 200L respectively. After 3 weeks of postpartum, total Total DNA samples were extracted and taken form heart、liver、spleen、lung、kidney and gonad of both the dam in female mice who had been immunizedvaccined at the end of week 3 of postpartum and the and 3, 6, 9 weeks offspring at postnatal 3, 6 and 9 weeks.of heart、liver、spleen、lung 、kidney and gonad were extracted, Tthe possibility of integration of DNA vaccine plasmids into mice genome was analyzed by PCR technology. By using primer amplification and gel electrophoresis detection, the results showed that after the DNA immunity on female mice, the frequency of all tissues gene integration (2.310-8) was far less than that of spontaneous mutation (210-6). As a result, it is considered that the pGM-CSF/SS Somatostatin Delivered will not integrate into the host genome and posseses higher biosafety.Key word: Somatostatin； DNA vaccine； biosafety； gene integration 121前言DNA疫苗是指将编码外源性抗原的DNA插入到含真核表达系统的载体上，然后直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，该抗原蛋白可直接诱导机体产生免疫应答，并逐渐地显示出它作为第三代疫苗的优越性。与传统疫苗相比，DNA疫苗有以下的优点，DNA 疫苗有以下优点： 是把抗原以天然的形式提供给免疫系统；可诱导长期或终身免疫； 可同时引起体液免疫和细胞免疫,保护力强；对不同亚型的病原体有交叉抵抗作用；没有减毒活疫苗的可能在体内毒力回复后致病的危险； 质量易于控制和评价，DNA 序列清楚，纯化技术简便,可免除污染；生产迅速、简便、成本低廉，易于保存和运输,无须冷藏； 易于针对相同或不同病原体的多种抗原分子进行联合接种。DNA疫苗的上述优势使它在近年来发展尤为迅速，并引起了研究人员的广泛关注。但是作为将要面对大量人畜群的新型疫苗,其生物安全性问题是人们普遍关心的问题，也是多种DNA疫苗从实验室走向临床应用所需解决的关键问题。生长抑素（somatostatin,SS）是下丘脑释放的14肽激素。SS主动免疫能刺激机体产生特异性抗体，中和内源性SS，使与生长和泌乳相关的激素释放增加，从而促进动物生长，在畜牧生产中有巨大的应用前景（Spencer and Willamson, 1981没有参考文献。注意：正文必须与参考文献一 ）。在基因疫苗兴起时代，以pcDNA3.1(-)为真核表达载体的多种生长抑素基因疫苗，可在HELA细胞高效表达（曹少先等，2004）, 在多种动物身上进行了生长增重提高的验证试验,可引起较好的体液免疫反应和促生长效果（曹少先等，2007；薛春林等，2007；舒邓群等，2006）。为了增强机体免疫反应从而提高其促生长效力，将pCS/2SS与辅助刺激因子粒细胞集落细胞刺激因子GM-CSF构成融合表达质粒,并以减毒沙门氏菌CSO22作为传递载体（舒邓群等，2006），在小鼠和断奶仔猪的口服免疫试验都显示（梁爱心等，2006；舒邓群等，2007），同以往构建的疫苗相比,其对体重增长有更好的促进作用,并能相应的提高与生长相关的GH和IGF-1的分泌，是目前为止构建的最经济、高效的DNA疫苗。但是，作为一种将要面对大量人畜群的新型疫苗，我们在确保它的质量、效力的同时，其安全性也是实际生产应用前需解决的主要问题。基因疫苗的安全性除需要考虑传统疫苗的靶器官和生殖毒性外，还需对基因的整合，免疫耐受，自身免疫生物分布评价，接种部位抗原表达持续时间等进行安全性分析（Manam S, 2000）。其中，外源质粒DNA是否与宿主基因组DNA发生整合，是DNA疫苗安全性研究中最为研究者关注的一个问题。为此，本试验就生长抑素基因疫苗生物安全性问题进行研究，即主要为生长抑素基因疫苗上的基因是否会整合到宿主基因组DNA中，使宿主细胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主细胞转化成癌细胞，以及疫苗是否会整合到仔代基因组中。结合已做的安全性研究，本研究将GM-CSF与生长抑素pcS/2SS构成融合表达质粒pGM-CSF/SS,并以减毒沙门氏菌CSO22为传导载体,以在小鼠试验获得最佳增重效果的剂量（200L, 2 1010cfu/ mL/只）来免疫小鼠,验证pGM-CSF/SS疫苗对妊娠母鼠及其子代的安全性，运用PCR技术（Wolf JJ, et al, 2007）检测其同母、仔两代基因组整合的可能性，以期为生长抑素基因疫苗从实验室进入临床应用提供必要的安全性数据资料，促进临床试验的开展。2材料和方法2.1 材料2.1.1免疫用基因疫苗：以减毒沙门氏菌为载体pGM-CSF/SS菌株由所做实验实验室的研究室构建和保存。 2.1.2试验用小鼠：4周龄20克左右雌性昆明小鼠45只，10只性成熟雄性昆明小白鼠均购自湖北省疾病控制中心。2.1.3试验用仪器：电子天平；不同型号移液器；一次性塑料手套；高压灭菌锅；-20冰箱；恒温水浴摇床；DNA浓度测定仪；恒温培养箱；冷冻离心机；超净工作台；PCR仪；琼脂糖凝胶成像系统。2.1.4主要试剂：限制性内切酶Hind 和Xho、Taq酶、Dntp、琼脂糖、琼脂粉、蛋白酶K、平衡酚购自武汉凌飞科技有限公司。DNA marker 、DNA凝胶回收试剂盒购自捷瑞有限公司。其他试剂具体如下:PBS溶菌液为pH 7.4、10 mmol/L的磷酸盐缓冲液,LB培养基为胰化蛋白胨、酵母提取物和氯化钠组成的液体培养基,氨苄青霉素（过滤除菌）。2.1.5主要试剂的配制： （1） pH=7.4的PBS:用1000ml蒸馏水溶解8gNacl、0.2gKcl、3.58gNa2HPO4.12H2O和0.24gKH2PO4，用Hcl调节溶液的PH值至7.4，加水至1L，粉状后高压蒸汽灭菌20min或通过过滤除菌，包存于室温。（2）3mol/LpH=5.2和pH=7.0的乙醇钠：用800ml水溶解408.3g三水乙醇钠，用冰乙酸调节PH值至5.0或用稀乙酸调节PH值至7.0，用蒸馏水定容至1L，分装成小份，高压蒸汽灭菌。（3）1molSET:1mol的Tr:S-Hcl(pH=8.0)25ml,0.5molEDTA（pH=8.0）1ml，称Nacl4.37g溶于适量水中，Nacl浓度150mmol定溶于500mlddH2O中。（4）液体培养基的制备：准备干净的量筒和烧杯，先量取950ml的双蒸水，在分别称取10g胰蛋白胨，5g酵母渗提物，10gNacl，再加入双蒸水定容到1000ml。将配置好的溶液倒入准备好的试剂瓶中，用纸盖子盖住并用透明胶封紧，然后放入高压灭菌锅中灭菌。2.2 试验方法2.2.1 重组沙门氏菌中质粒的提取及鉴定：质粒的提取：将细菌培养液在12000rpm，离心1min,去上清得沉淀加入100ml试剂（500mM葡萄糖、25mMTris-CL、10mMEDTA、pH=8.0）加入200L试剂（现配现用:0.2NNaOH+1%SDS轻颠摇3-5次，冰上置5min+44mlH2O）,再加150L试剂（3M醋酸钾、2M醋酸）加盖，颠摇几次，冰上置5-10min。12000rpm、4下离心10min，取上清液（约400L）,两倍体积预冷的无水乙醇混匀。12000rpm、4下离心10min，取沉淀倒置纸巾上，室温干燥除乙醇，即得质粒DNA。质粒的鉴定：所提质粒用Hind和Xho进行酶切鉴定，酶切体系: 10H buffer 1. 6 LL，重组质粒HindIII和Xho分别为0.8 LL，加ddH2O 至总体积16 LL，37反应2-3 h，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。2.2.2 疫苗准备：挑取pGM-CSF/SS和CSO22单菌落分别接种含抗生素（氨苄青霉素）和不含抗生素的液体LB培养基，37，200 r/min振摇培养至OD600值0.3-0.4，43 000 r/min离心10min，弃上清，用灭菌的PBS调整细菌浓度至21010cfu/mL，备用。2.2.3 试验动物免疫方法：预饲一周后，进行分组。将45只5周龄雌性昆明小白鼠随机均分为3组，其中C组灌注PBS溶液；A组灌注pGM-CSF菌液，浓度为21010cfu/ML；K组灌注空菌液，浓度为21010cfu/ML。分别于免疫前12h和4h禁食、禁水，并在免疫前30min，预先灌注7.5%的NaHCO3（每只100L）以中和胃酸，再进行免疫，剂量为每只200L。共免疫3次，每次间隔2周。2.2.4 试验动物的饲养及管理：饲养于本校专门的动物房，控制饲养温度在25左右，12小时光照，标准饲料和常规饮水饲养。实行笼养，每笼5只，每周进行一次卫生清洁。3免后第2天（约10周）与公鼠合笼，以见阴道栓为妊娠当天。2.2.5 组织样的采集和处理：母鼠哺乳期过后（产后第3周）眼球采血脱颈处死，无菌取完整的心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、生殖器官提取组织DNA。仔鼠分别于3，6，9周每组各取15只采用相同的方法提取组织DNA。组织DNA的提取与检测具体如下：1) 将组织样剪碎后用PBS冲洗，在8000r/min的转速下4离心10min弃上情。2) 在离心沉淀中加入1SET500L混匀，裂解细胞。在800r/min的转速下4离心10min，倒掉上清。3) 重复上一个步骤。4) 在沉淀中加入1SET500Lhe 10%SPS(终浓度为0.5%)30mL.再加入蛋白酶K（终浓度为50g/mL -100g/mlg/mL)，置于55水溶液中消化过夜。5) 上述消化液中加入等体积的平衡内分（pH=8.0）,缓慢颠倒离心管10min,4，800r/min离心10min。6) 小心吸取上层含有DNA的上清液移至另一离心管中，再次加入苯酚，重复操作（5）。7) 吸取的上清液中加入等体积的平衡酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），缓慢颠倒离心管10min,4，8000r/min离心10min。8) 吸取上清液后加入氯仿/异戊醇（24：1），缓慢颠倒离心管10min,4,8000r/min,离心10min。9) 吸取上清液，加入1/10体积的3MNaAc积2倍体积的无水乙醇，转动离心管，可见白色的絮状物，即为DNA，与-20放置30min.10) 取出冷冻后的样品，于12000r/min转速离心5 min -8min,去掉上层乙醇，假如70%的乙醇1mL洗涤沉淀，同样的速度离心5 min -8min。11) 弃去乙醇，在定温下，挥发残留乙醇，在加入适量TE溶解DNA12) 充分溶解后的DNA样品可在含有溴化已锭（EB）的0.8%琼脂糖胶上电泳检测，同时在DNA浓度测定仪上测定浓度。13) 稀释成一定的浓度，存放于-20备用。2.2.6 基因组DNA的质量检测及内参照PCR：先将同种处理的同种组织DNA混和,对各组织DNA进行浓度测定，调整浓度相同,并在PCR的扩增要求范围内，电泳检测有无游离条带，最后通过对小鼠保守基因 GAPDH 的扩增来检验基因组的完整性和均一性。内参PCR体系：扩增体系为20L，模板为0.4L上、下游引物（均为10m/L）各0.5L，dNTP （10mmol/L）0.4L，Taq DNA 聚合酶（2U/L）0.5L，10 倍PCR 缓冲液2L，加入ddH2O 至20L。基因组完整和保守性反应条件：94 10min，94 30s，64 45s, 72 45s，进行40个循环，72 10min。PCR引物序列：上游引物：AGCCTCGTCCCGTAGACAAAATGGT下游引物：GTGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTC该引物以鼠基因组为模板能扩增出1002bp长的片段2.2.7 PCR方法的敏感性和基因整合可能性的分析:本试验首先进行PCR体系的敏感性分析,将经过酶切鉴定提取的阳性质粒pGM-CSF/SS6.5Kb的浓度调整然后以10倍浓度来倍比稀释,分别将0.1g加入到0.3g未免疫质粒的小鼠组织基因组中,保证模板中含有10的倍数的质粒拷贝数（105-10-2）（Haworth R et al, 2000; Kanellos T, 1999）按基因整合分析反应条件进行扩增：0.4L上、下游引物（均为10m/L）各0.5L，dNTP （10mmol/L）0.4L，Taq DNA 聚合酶（2U/L)）0.5L，10 倍PCR 缓冲液2L，加入ddH2O 至20L。基因整合分析反应条件：94 10min，94 30s，52 45s，72 45s，进行40 个循环；72 10min。1%的琼脂糖凝胶电泳检测有无848bp条带出现。对pGM-CSF/SS质粒所设的引物为：上游引物：CCCTGAGCCTTCTAAACA下游引物：TGATGGGATGGGAATACA以该引物扩增核酸疫苗质粒可得到848长度的片段。3 结果与分析3.1 重组质粒pGM-CSF/SS的酶切鉴定所提质粒用Hind和Xho进行酶切鉴定，经酶切后结果显示（图1），有两条目的片断，其中一条在1kb1.5kb之间（目的片段为1245bp），另一条5kb，与所要的结果吻合,证明该质粒是pGM-CSF/SS。图1. pGM-CSF/SS质粒酶切鉴定Fig.1. Identification of pGM-CSF/SS by restriction endonuclease digestionDNA Marker: 1500bp pGM-CSF/SS digestion by Hind和Xho3.2PCR敏感度检测如图2，其中原是质粒原样，1为PCR模板中含有109个拷贝的质粒，然后10倍逐步稀释，6-12是含有104-10-2个拷贝的质粒,由电泳图谱可以看出当模板只含有1个拷贝的质粒，PCR体系扩增产物仍能获得条带，表明本试验所建立的PCR法敏感度可达1个拷贝级，为了确保扩增结果更加稳定，选用10个拷贝级的质粒作为阳性对照来进行基因整合的检测。图2. 质粒pGM-CSF/SS的PCR灵敏度 Fig.2. The sensitivity of PCR for detection of pGM-CSF/SS plasmid 2)Lanel-5, 7-10:nave mice purified genomic DNAplus 1010, 109, 104, 103, 102, 10, 1, 0.1, 0.01copies of pGM-CSF/SS plasmid repectively; Lane11,water control; Lane6:1500 Marker3.3母鼠及仔鼠基因组DNA质量检测琼脂糖凝胶电泳直接检测母鼠和仔鼠基因组DNA，发现所提取DNA比较完整，基本无游离条带,无RNA污染，也不含游离质粒,母鼠和仔鼠结果一致,显示一张结果(图3)。所提取的组织DNA纯度基本都在1.8左右，调整DNA浓度在50ng/L以上。以GAPDH的引物来扩增所有的组织，发现试验组，对照组，母鼠和仔鼠所扩增的条带结果一致,并且与所要条带大小一致.提取的基因组DNA比较完整和均一,因而只显示一张电泳结果。(图4),其中1-6分别为母鼠的心、肝、脾、肺、肾、生殖组织,7-12为仔鼠的心、肝、脾、肺、肾、生殖组织。图3 基因组DNA电泳结果 Fig.3. The electrophoresis result of genomic DNA of mice 3)Lane1-2, 4-7:heart, liver, spleen,lung,kidney and gonad of mice；Lane3:10000Maker 图4 基因组DNA内参GAPDH PCR扩增结果Fig.4. PCR analysis ofgenomic DNA as template by GAPDH4)Lane1-6:heart,liver,spleen,lung,kidney and gonad of female mice；Lane8-13:Heart,liver,spleen,lung ,kidney and gonad of offspring；Line7:1500Marker3.母鼠及仔鼠基因整合检查母鼠的各内脏和性腺组织，3、6、9周仔鼠各内脏和性腺组织PCR扩增产物检测结果显示，所有的内脏和性腺组织都没有生长抑素基因整合到基因组DNA中，选取的阳性对照是10个拷贝的质粒，阴性对照模板加纯水。所以可以得出在拷贝数为10的检出限内，无基因的整合发生。（图5,图6） 图5 母鼠检测基因组DNA中质粒pGM-CSF/SS的PCR结果Fig.5. Representative PCR for pGM-CSF/SS plasmid in genomic DNA samples of female mice5)Lane1-5,7, heart,liver,spleen,lung,kidney and gonad of female mice；Lane8,1 copies pGM-CSF/SS plasmid of masccline control；Lane9,warter control；Lane6,1500Maker图6仔鼠检测基因组DNA中质粒pGM-CSF/SS的PCR结果Fig.6. Representative PCR for pGM-CSF/SS plasmid in genomic DNA samples of offspring6)Lane3-8,heart,liver,spleen,lung,kidney and gonad of offspring；Lane2, 1 copies pGM-CSF/SS plasmid of masccline control; Lane1,warter control；Lane9,1500Maker4 讨论近年来，DNA疫苗受到广泛关注并获得了迅速的发展。实验室自构建生长抑素基因疫苗以来,先后进行了多次优化,基于免疫效力和安全性考虑的质粒构建的优化 (包括单拷贝生长抑素DNA疫苗、双拷贝生长抑素DNA疫苗、以沙门氏杆菌为传递载体的生长抑素DNA疫苗)；为提高经济效益和提高免疫效力免疫方式的转变(肌注,灌胃,等)；最后在多种动物体上进行了应用性验证,到目前为止,已经初步证明了所制备的生长抑素基因疫苗对动物有很好的促生长作用,具有很大的应用潜力。但是作为一种新型的核酸疫苗,它的安全性一直是人们最关心的问题,这直接关系到它能否应用于实际生产中。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)与美国食品和药物管理局(Food And Drug Administration，FDA)对DNA疫苗的临床前安全性研究做出了相关规定。主要包括：(1)注射的DNA疫苗可能整合到宿主染色体中，导致插入性诱变；(2)生殖毒性研究，可采用PCR方法对经质粒DNA疫苗免疫的雄性或雌性的性腺DNA提取物进行监测；(3)外源性蛋白长期表达可导致免疫病理反映；(4)注射的DNA可能产生自身抗体，并可能导致自身免疫反应；(5)与细胞因子合用可能导致的其他风险；(6)表达抗原的自身可能有生物活性。目前，在DNA疫苗研究中，pGM-CSF/SS DNA疫苗作为一种应用性促生长疫苗,结合其经济利益,我们首要考虑它的安全性问题就是其整合到宿主基因组的可能性。4.1 关于免疫组各组细胞基因组DNA的提取分析由于质粒DNA存在进入细胞核整合入宿主细胞基因组DNA的可能性,因此分离细胞浆中的质粒DNA与整合入宿主细胞基因组中的质粒DNA是本试验中的关键。试验中免疫组各组织基因组DNA在提取过程中，组织细胞胞浆中的pGM-CSF/SS难免将混入组织细胞基因组织DNA中，造成细胞基因组DNA的污染，以此污染的组织细胞基因组DNA为模板，经PCR检测出的假阳性整合率相当高。因此，应将初提的基因组DNA经琼脂凝胶电泳再次回收提纯,避免细胞浆中的pGM-CSF/SS对基因组的污染，保证了试验的准确性。4.2 关于PCR敏感性分析PCR方法是一种重要而常用的分子生物学方法，其越来越多地应用于核酸药物，如核酸疫苗和基因治疗的安全性评价中。但用PCR方法检测质粒DNA是否与宿主染色体发生整合时，方法的敏感性及排除游离质粒的影响，是决定检测结果可靠性的重要因素（Haworth R et al, 2000；Kanellos T et al, 1999）。应用定量PCR仪检测基因组DNA中所含有的质粒DNA的含量是一种很好的方法。但是，经验告诉我们，目前的定量PCR方法检测灵敏度在1000个拷贝左右，低于1000个拷贝时，结果不稳定。所以本试验使用普通PCR方法，经过对模板浓度的梯度稀释检测了PCR方法的敏感性。结果发现，所用方法的敏感性由电泳图谱可以看出当模板只含有1个拷贝的质粒，PCR体系扩增产物仍能获得条带，表明本试验所建立的PCR法敏感度可达1个拷贝级，为了确保扩增结果更加稳定，选用10个拷贝级的质粒作为阳性对照对各组织进行随机插入的可能性分析。4.3 关于pGM-CSF/SS基因整合的可能性分析质粒DNA通过宿主细胞膜上的DNA受体介导的胞饮作用内吞入宿主细胞中，主要在宿主细胞浆中完成转录与表达，同时质粒DNA也可以通过细胞核的核孔区进入细胞核，故也存在整合入宿主细胞基因组的可能性，由于细菌的质粒DNA是一种独立于细胞染色体的具有自我复制功能的核酸分子，不具备逆转录病毒的染色体插入序列，因此在理论上不会与细胞组DNA整合。然而质粒DNA被机体吸收后，局部组织细胞可能存在高浓度的质粒DNA分子，因此不能排除质粒DNA与基因组DNA发生随机整合的可能性(刘建文等，2004)。外源DNA随机整合入宿主基因组与致癌性相关，主要包括两方面：（1）质粒DNA整合入宿主细胞基因组DNA可能导致原癌基因的激活或抑癌基因的失活。整合可分为三类：随机插入，同源重组，逆转录病毒插入。后两者在质粒设计时均可避免，据报道，同源重组的整合的重要条件之一就是在宿主细胞基因组DNA上和质粒DNA上有600bp高度同源的片断，为了避免同源重组，在质粒设计时需要检查在以序列与免疫对象染色体同源问题，应尽量去掉同源性序列和非必需序列，以减少同源重组的危险及载体相对分子质量。DNA疫苗以随机整合为主。但如此微量的质粒的存留，其整合几率微乎其微。（2）抗原基因是否具有转化作用。在选择原蛋白是应尽量避免使用有转化功能的基因或癌基因，使用研究较透彻的抗原基因，若没有选择余地时，可将突变或形成融合蛋白灭活转化活化。从而保证使用基因的安全性。经分析基因组序列发现发生同源重组的概率很低。本试验的基因组DNA经过分析显示,我们提取的基因组比较完整均一,而且在免疫后约6周处死后电泳结果显示母鼠各组织无游离质粒,在仔鼠各组织也无游离质粒,说明游离质粒已基本从体内代谢出去。利用PCR方法检测质粒DNA是否与宿主染色体发生整合时，在无游离质粒干扰的情况下,本试验对疫苗免疫后与宿主基因组随机插入的可能性进行分析。本试验采用普通PCR方法，经过对模板浓度的梯度稀释检测了PCR方法的灵敏性。试验结果显示,PCR体系所能检测到的阳性质粒的灵敏度为10个拷贝数，以此数目作为阳性对照,对各组织进行随机插入的可能性分析。PCR结果说明0.3g 基因组DNA中整合质粒远远小于10个拷贝。在假定是有10个拷贝插入的前题下,1g 基因组DNA 约相当于150000个哺乳动物双倍体细胞中DNA，按每个细胞有50000个基因计算（Ledwith BJ et al, 2000；郑风荣等，2006）,则每个细胞的整合率为2.3 10-8,仍比基因的自然突变率2 10-2（吴琳等，2006）要低两个数量级。哺乳动物染色体组中的基因在不断地发生自发突变,只要其发生的频率对于每个基因来说不超过1 10-6,就不会对动物的健康造成影响（程从升等，2005）。由此可见,既便是DNA疫苗有可能和细胞基因组DNA 发生随机的整合,其频率也远远低于自发突变的几率,结果证实本实验室所使用的疫苗具有较高的安全性。但基因疫苗的安全性要从遗传、免疫、毒性和环境效应多个方面来考虑（Schalk JAC et al,2006）。以后仍需要对质粒的抗性基因,自身免疫等其他影响疫苗安全性的环节进行改善和验证,从而使疫苗能够尽快地实现临床应用。5 结论从基因随机整合可能性的临床前研究证明, 其构建的生长抑素基因疫苗具有较高的生物安全性，无随机整合入宿主的可能性，对其母鼠及后代的也无整合现象及残留问题,可以放心地应用于临床，虽然目前没有证据证明外源基因与宿主染色体的整合，但在理论上仍然存在整合的可能，因此这个问题不能忽视，若DNA疫苗与宿主染色体发生整合时，将发生难以预料的严重后果。当然我们仍需对疫苗的其他安全性问题继续进行临床前的研究，以期疫苗能尽快从实验室走向实际应用。参考文献1. 白天DNA疫苗、DNA疫苗-脂质体复合物在鸡体内的分布安全性研究硕士学位论文四川：四川农业大学，20062. 曹少先，杨利国，峁达干，张文伟，管峰生长抑素基因疫苗pcS/SS构建及其在HeLa细胞的表达J中国兽医学报，2004，24：153-1563. 曹少先，杨利国，张文伟，峁达干，管峰生长抑素基因疫苗质粒pcS/2SS的构建、表达及免疫农业生物技术学报J，2005，13(4)：477-4814. 曹少先，杨利国，张文伟，峁达干，何晓虹生长抑素基因疫苗质粒pEGS/2SS的构建及表达中国兽医学报J，2005，25：499-5025. 曹少先，杨利国，孙延鸣，刘铁铮生长抑素基因疫苗PES/2SS构建，表达及免疫扬州大学学报（农业与生命科学版），2007，28：5-86. 程丛升，王文成，李素，扈荣良，猪瘟DNA疫苗在猪体及环境的生物安全性研究微生物学宝，2005，45(2)：292-2977. 付洁，宋海峰 核酸疫苗的药动学与安全性研究进展中国新药杂志， 2006，15(5)：337-3408. 梁爱心，杨利国，姚艳风，金定恩，武瑞等小鼠对PGM-CSF/SS生长抑素基因疫苗的免疫应答华中农业大学学报，2006，25(5)：540-5439. 梁昊宇, 曾明. 新疫苗和佐剂的临床前安全性评价国际生物制品学杂志，2006，29：202-20510. 舒邓群，茆达干，杨利国，等以减毒沙门氏菌为载体的GM-CSF与生长抑素融合表达质粒对小鼠淋巴细胞增殖和GH及IGF-1分泌的影响J畜牧兽医学报，2006a，37(2):81481811. 舒邓群, 茆达干, 陈荣达, 吴志敏, 杨利国. 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与生长抑素融合表达质粒对断奶仔猪生长及相关激素的影响南京农业大学学报，2007，30(4)：92-9612. 舒邓群. 核酸佐剂GM-CSF的克隆及其对生长抑素DNA疫苗的免疫增强作用博士学位论文.南京：南京农业大学图书馆，2006b13. 吴琳，刁振宇，邓小昭，高健，周宗安，刘玉，王元伦猪囊虫DNA疫苗在猪体的组织分布及安全性探讨药物生物技术，2006，13(1)：014-01614. 薛春林，杨利国，峁达干，王勇.生长抑素DNA疫苗对湖羊羔生长和相关激素的作用佐剂效应南京农业大学学报，2007，30(2):89-9315. 薛春林，杨利国.生长抑素DNA疫苗对小鼠CPG DNA的促进效应.中国农业科学，2007，6(7):101-10516. 杨锦波，刘天佳，李继遥抗龋基因疫苗pcDNA3-gtfB整合宿主细胞基因组DNA的可能性研究华西口腔医学杂志，2003，21(3)：228-23017. 郑风荣，孙修勤，刘洪展，吴谡琦，张进兴，曲凌云，洪旭光亚鲆淋巴囊肿病毒核酸疫苗的安全性研究高技术通讯，2006，16(1)：106-11018.19. 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