STR发展及应用.ppt

STR及其法医学应用 蔡福营2007 2 8 一 STR研究发展过程 人类基因组遗传标记发展过程 第一代遗传标记RFLP第二代遗传标记STR第三代遗传标记SNP 用于个体识别的遗传标记的发展 1985 1990 1994 1996 1998 2000 2002 1992 CapillaryelectrophoresisofSTRsfirstdescribed FirstSTRsdeveloped FSSQuadruplex FirstcommercialfluorescentSTRmultiplexes CODISlocidefined STRtypingwithCEisfairlyroutine Identifiler5 dyekitandABI3100 PCRdeveloped PowerPlex 16 16lociinsingleamp 2006 DNAisanimportantpartofthecriminaljusticesystem 2004 2006 Y STRs www dna govJusticeforAllAct 1Bover5years MultiplexSTRs mtDNA 法医领域STR发展前景 http www ojp usdoj gov nij pubs sum 183697 htm 美国国家司法局 nationalinstituteofjustice 调研报告2000年11月份评估DNA证据在未来2 5 and10years的发展前景结论STRtypingisheretostayforafewyearsbecauseofDNAdatabasesthathavegrowntocontainmillionsofprofiles 法医学遗传标记的发展方向 提供更多信息的STR检测试剂盒 新的位点和其它生物学特征 miniSTR 迷你STR 长度较短 100bp左右 SNP 与个体特征相关如肤色 毛发等的单核苷酸多态性位点 二 STR生物学特征 STR shorttandemrepeat 短串联重复序列 微卫星 microsatellite SSR simplesequencerepeat 结构特征 序列重复 分为简单重复 simple 和复杂重复 complex 分布于基因之间STR基因座命名原则 STR是重复单位长度为2 6核苷酸的重复DNA序列 Dinucleotide CA CA CA CA Trinucleotide GCC GCC GCC Tetranucleotide AATG AATG AATG Pentanucleotide AGAAA AGAAA Hexanucleotide AGTACA AGTACA ThesecategorieswerefirstdescribedbyUrquhartetal 1994 Int J LegalMed 107 13 20 STR重复复杂程度分类 STR在人类基因组中分布广泛 HGP带来更多STR认识目前被鉴定出的4核苷酸重复超过20 000个 Collinsetal AnexhaustiveDNAmicro satellitemapofthehumangenomeusinghighperformancecomputing Genomics2003 82 10 19 整个基因组中STR数量可能超过100万 EllegrenH Microsatellites simplesequenceswithcomplexevolution NatureRevGenet2004 5 435 445 STR占整个人类基因组序列的3 Landeretal Initialsequencingandanalysisofthehumangenome Nature2001 409 860 921 STR命名原则 国际法医血液遗传学会 InternationalSocietyofForensicHaemogenetics ISFH 1994 1997年提出命名原则DNA链的选择 编码区和非编码区 主型选定和等位基因命名 5 GGTTATTATTATGG 3 5 GGTTATTATTATGG 3 经典STR检测分析方法 设计位点特异性的引物 用PCR方法扩增得到STR片段电泳检测扩增产物长度 并与allelicladder对比检测方法 PAGE 银染 荧光标记 测序仪 遗传分析仪 基于STR长度不同来分辨 MultiplexPCR多重 复合PCR 复合扩增的优势 一次反应获得更多信息量降低成本 减少工作量 提高效率模板需求量低 在同一反应体系中加入两对或更多引物 同时扩增得到 复合扩增的难点 多对引物相互作用反应条件一致非特异性产物 荧光标记的分析方法 毛细管电泳图谱 三 STR分型中经常遇到的现象 Stutter影子带不依赖模板的加A作用Offladder的微变化等位基因三等位基因 Tri allele 无效等位基因 Nullalleles 遗传突变 Mutation 影子带stutter 通常比主带少一个重复单位 由于滑动复制引起 也可以见到多一个 重复单位越大 stutter越低 2 3 4 5 重复长度越长 stutter越高Stutter产量依次减小 主带 1 2 导致混合样本分型困难 影子带的产生 图片改为gene8 Trueallele tetranucleotiderepeat n 4stutterproduct n 4stutterproduct Insertioncausedbyslippageofthecopying top strand Repeatunitbulgesoutwhenstrandbreathingoccursduringreplication Deletioncausedbyslippageonthecopied bottom strand Occurslessfrequently typically 2 oftendowninthe noise dependingonsensitivity Typically5 15 oftruealleleintetranucleotiderepeatsSTRloci 不依赖模板的加A作用 Taqpolymerase具有不依赖于模板在扩增产物的3 末端加一个核苷酸 通常是A 的性质 具有高保真性的Taq酶例外 反向引物的5 端如果是G 可以增加加A的效率 也可以添加一个6核苷酸的tailPCR反应程序最后60度或72度保温15 45分钟酶活力不够 可能导致加A效率低 出现双峰现象 如 过量模板可能导致 体系中含有反应抑制物等 5 末端核苷酸对加A效率的影响 PromegaincludesanATTsequenceonthe5 endofmanyoftheirunlabeledPP16primerstopromoteadenylationseeKrenkeetal 2002 J ForensicSci 47 4 773 785http www cstl nist gov biotech strbase PP16primers htm Figure6 5 J M Butler 2005 ForensicDNATyping 2ndEdition 2005ElsevierAcademicPress 过量模板可能导致加A不完全 Microvariantoffladder现象 重复次数不是基本重复单位的整倍数或者序列跟基本重复单位不同或者这两者同时存在非整倍重复的等位基因命名方法 完整重复数 点 部分重复数 Baretal Int J LegalMed 1994 107 159 160 例子 TH019 3allele TCAT 4 CAT TCAT 5 三等位基因 Three PeakPatterns 类型2 三个峰高度相似 主要发生于TPOXandD21S11 类型1 两个峰高度之和与第三个峰高相同 D18S51 主要发生于D18S51 TPOX Claytonetal 2004 AgeneticbasisforanomalousbandpatternsencounteredduringDNASTRprofiling JForensicSci 49 6 1207 1214 1137号样本GE16A检测结果 STRBase中的微变化和三基因案例 Off LadderAlleles Tri AllelicPatterns http www cstl nist gov biotech strbase var tab htm Currently328at13 13CODISloci F13A01 FES FPS PentaD PentaE D2S1338 D19S433 Currently80at13 13CODISloci FES FPS Nullalleles 无效等位基因 样本DNA中含有该等位基因 但是由于没有被扩增和检测到 由于引物结合部位发生突变导致 能够导致杂合子表现为纯合子 影响了DNA数据库比对不同引物体系检测同一样本可能得到不同结果新的STR检测试剂盒在应用之前需要与已有产品进行大量的比对试验Goldeneye16A与Identifiler和PowerPlex16比对目前没有发现这一现象 8 8 6 6 8 Allele6ampliconhas droppedout Imbalanceinallelepeakheights Heterozygousallelesarewellbalanced 引物结合部位发生突变对扩增的影响 没有突变 结合位点3 端突变 alleledropout 结合位点中部突变 Butler J M 2005 ForensicDNATyping 2ndEdition Figure6 9 ElsevierAcademicPress 遗传突变mutaiton 无突变时遗传规律 父系突变 图谱为某市公安局06Q248号亲子鉴定三联体样本D8S1179位点 父 母 子 等位基因由亲代向子代遗传过程中不遵循孟德尔遗传定律 突变特点 突变普遍存在 发生在生殖细胞减数分裂过程中突变率通常为1 1000减数分裂父系突变通常高于母系突变VWA FGA andD18S51突变率最高TH01 TPOX andD16S539突变率最低 商业化STR分型产品 ABI公司 美国 国内市场占有85 左右 国际 Promega公司 美国 国内市场占有15 左右其他外国公司 德国 澳大利亚 公安部第二研究所 物证鉴定中心 江西中德生物珠海科登 codon 目前研发的公司和机构 13个CODIS核心STRLoci及其染色体定位 CSF1PO D5S818 D21S11 TH01 TPOX D13S317 D7S820 D16S539 D18S51 D8S1179 D3S1358 FGA VWA AMEL AMEL 主流产品STR位点比较 11CODIS TH01 TPOX Amel D2 PE D6 ABIID PP16GE16A DNATyper15 11CODIS TH01 TPOX Amel D2 D19 D6 D12 ABIChina Goldeneye16A FAM HEX TMR PromegaPP16kit FAM JOE TMR D5155 205 D13205 250 D7251 300 D16260 300 CSF300 350 D2305 370 FGA210 360 D8120 180 D12215 275 A Vwa151 215 D3100 150 D6120 200 D21185 250 D18280 360 D19100 150 ABIChinakit FAM NED VIC JOE DNATyper15 D5120 165 D13155 190 D7240 280 D16255 300 FGA330 400 CSF285 340 D3100 150 D6100 165 D8195 250 D2340 400 A Vwa170 225 D21170 230 D18230 310 PentaE300 420 FAM HEX TMR 在研或即将研究项目 将ABO血型检测与STR分析整合 世界首创 SNP STR 同时扩增效果良好不适宜分析血型的样本 如精斑 唾液 骨骼等 也可以判断血型血型数据是丰富的资源 值得利用缩小样本筛查范围 减少检测样本数量 节约经费 ABO 16A Goldeneye18A 兼容已有的数据库信息一次反应获得更多的信息更高