复发性流产患者外周血调节性T细胞检测及临床意义.doc

复发性流产患者外周血调节性T细胞检测及临床意义作者：李成,张强单位：【摘要】 目的 探讨不明原因复发性流产患者外周血以CD4+CD25high-intCD127lowTreg(CD4+CD25high-intCD127lowT regular cells)为代表的调节性T细胞表达及其意义。方法 采用三色荧光抗体标记及流式细胞术分析20例不明原因复发性流产患者、正常妊娠组和正常非孕对照组外周血CD4+CD25high-intCD127lowTreg占CD4+T淋巴细胞的比例。结果 正常孕妇外周血CD4+CD25high-intCD127lowTreg较正常对照组差异有统计学意义（P<0.01），复发性流产患者CD4+CD25high-intCD127lowTreg调节性T细胞较正常对照组差异有统计学意义（P<0.01）,正常孕妇组较复发性流产患者组差别则更显著；其中流产次数小于或等于3次的患者与流产次数大于或等于4次的患者其外周血CD4+CD25high-intCD127lowTreg占CD4+T细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 原因不明复发性流产患者外周血中调节T细胞比例降低，这种改变导致原因不明复发性流产患者细胞免疫耐受被打破，可能是原因不明复发性流产患者发病的重要原因之一。 【关键词】 复发性流产；调节性T细胞；流式细胞术Significance of measurement of regulation T cells in peripheral blood of patients with recurrent spontaneous abortion Li Cheng，Zhang Qiang Department of Clinical Laboratory, Bengbu Second Peopless Hospital, Bengbu 233000AbstractObjective To investigate the expression and significance of CD4+CD25high-intCD127lowTreg(CD4+CD25high-intCD127lowT Regular Cells) in the peripheral blood(PB) from patients with unexplained recurrent spontaneous abortion(URSA),to explore the mechanism of autoimmune intolerance in URSA.Methods The proportion of CD4+CD25high-intCD127lowTreg in the PB of three groups of people (URSA patients that they had been diagnosed clearly, normal non-pregnant women and the normal pregnant woman) analyzed by triad colour fluoresce-labeled monoclonal antibody and using multiparameter flow cytometry.Results The proportion of CD4+CD25high-intCD127lowTreg/T CD4+ cells in the normal pregnant woman was significantly higher htan those in control group(P<0.01); the proportion of CD4+CD25high-intCD127lowTreg/T CD4+ cells in URSA patients was significantly lower than those in control group(P<0.01).Conclusion The percentages of CD4+CD25high-intCD127lowTreg was decreased, which break down the autoimmune tolerance in URSA, these changes of CD4+CD25high-intCD127lowTreg in number might participate in onset of URSA, it may be correlated to pathogenesis of URSA. Key wordsRecurrent spontaneous abortion; Regulatory T cell; Flow cytometry 近代生殖免疫学研究认为，正常妊娠是一个类似于同种异体移植的复杂生理过程，并逐步认识到胚胎携带1/2有异于母体的组织抗原，然而不被母体免疫系统排斥的实质是依赖于母胎之间的免疫耐受关系，这一耐受一旦失调，从而导致母胎免疫失衡，将可能发生包括原因不明复发性流产在内的病理妊娠，其中多因母体对胚胎的免疫排斥所致多见。调节性T细胞是一群重要的具有免疫抑制功能的T细胞亚群，能抑制CD4+、CD8+等T细胞活化及增殖，它在防止自身免疫性疾病的发生、诱导移植耐受等方面发挥重要的作用。而调节性T细胞中又以CD4+CD25high-intCD127lowTregT最具代表性1。因此本研究拟采用三色免疫荧光标记技术和流式细胞术来检测以CD4+CD25high-intCD127lowTreg为代表的调节性T细胞在患者外周血中变化及其临床意义。1 资料与方法1.1 试验对象 正常非孕组：正常妇女，15例，年龄2333岁，平均29.7岁，系来我院体检的正常健康妇女。排除全身系统性疾病，无生殖道畸形、生殖道器质性及免疫相关性疾病，月经周期规律，既往无自然流产史，采集外周血，肝素抗凝。正常妊娠组：正常妊娠妇女10名，妊娠611周，年龄2436岁，平均29.5岁，其他条件同上，正常妊娠来我院做正常检查的，征得本人同意后采集外周血，肝素抗凝。复发性流产组：20例，为2006年7月至2008年4月就诊于我院门诊的患者，年龄2336岁，平均28.4岁，自然流产次数≥3次，按常规进行病因筛查，排除染色体、解剖结构、内分泌等方面的异常及感染，排除自身免疫性疾病等，采集外周血，肝素抗凝。1.2 主要试剂与仪器 小鼠抗人CD25-FITC、CD127-PE，CD4-APC及同型无关对照均为美国Bechman-coulter公司产品。EPICS-XLII型流式细胞仪购自美国Bechman-coulter公司1.3 方法1.3.1 样本采集及处理 所有受试对象抽取静脉血2 ml，均用肝素钠抗凝，5 h内用流式细胞仪分析。1.3.2 流式细胞仪分析 取抗凝全血100 μl，分别加入APC标记的CD4抗体，FITC标记的CD25抗体各20 μl,PE标记的CD127抗体5 μl，平行设3管同型对照。室温下避光孵育30 min，加溶血剂10 min，振荡混匀，PBS洗2次，加入400 μlPBS重新浮悬细胞，流式细胞仪分析，并算出CD4+CD25high-intCD127lowTreg占CD4淋巴细胞百分比。1.4 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件分析，采用单因素方差分析及t检验分析数据，以P<0.05为差异有统计学意义。2 结果 正常非孕组，正常妊娠组及复发性流产患者外周血中CD4+CD25high-intCD127lowTreg调节性T细胞占CD4+T百分比结果见表1。正常非孕组CD4+CD25high-intCD127lowTreg调节性T细胞较正常妊娠组差异有统计学意义（P0.01）；复发性流产组患者CD4+CD25high-intCD127lowTreg调节性T细胞较正常非孕组差异有统计学意义（P0.01）。表1 各组外周血中CD4+CD25high-intCD127lowTreg调节性T细胞水平组别例数Treg(略)复发性流产患者，其中流产次数小于或等于3次的患者其外周血CD4+CD25high-intCD127lowTreg调节性T占CD4+T百分比与流产次数大于或等于4次的患者差异无统计学意义（P0.05），见表2。表2 复发性流产患者流产次数与CD4+CD25high-int略)3 讨论 正常妊娠类似于同种异体移植，作为同种移植物的胚胎在母体内存活直至分娩，实际上反映了母体对胚胎的免疫耐受，而妊娠失败多因母体对胚胎的免疫排斥所致，人类自然流产的发病率高达30%以上，对于自然流产连续发生3次或3次以上的反复自然流产的研究显示，80%以上与妊娠期免疫功能调节紊乱密切相关，而其中相当一部分与母胎免疫耐受机制紊乱有关。现在认为，免疫耐受的维持（特别是外周免疫耐受的维持）可以通过自我干预的免疫调节机制即通过调节性T细胞有效抑制同种异体反应性细胞介导的免疫反应而实现2。 Sakaguchi等于1995年首次发现并报道小鼠和人的外周血及脾脏组织的CD4+T细胞中有一群细胞持续高表达CD25分子（IL-2受体α链），并将此类细胞命名为CD4+CD25+T调节性细胞，简称为CD4+CD25+Treg（CD4+CD25+T regular cells），这种CD4+CD25+Treg具有在体外呈低反应性，并具有抑制CD4+CD25-、CD8+等效应性免疫细胞的反应性活化与增殖3。随着研究的逐步深入，认识到该型细胞除与控制自身免疫性疾病的发生、发展密切相关外，而且在维持自身免疫耐受及调节适应性免疫应答中也发挥重要作用4。近年来研究还显示小鼠CD25表达的荧光强度比较均匀一致，CD4+CD25+T细胞群基本上代表着调节性T细胞，而人CD25+T细胞与CD25T细胞群无明显隔离，呈连续分布，其中CD25强阳性的CD4T+细胞（CD4+CD25high)绝大多数为特异的CD4+调节性细胞，而中等及弱阳性的CD4+T细胞（CD4+CD25int-low)混杂有相当数量的帷本内外各种信号刺激后活化的效应性T细胞4。因此在人类CD4+CD25+双标记并不能真实反映机体内CD4+Treg细胞的数量。研究还显示FoxP3可能是调节性T细胞最特异的标记物5、6，而且我们目前在基因水平及蛋白水平上均检测到单细胞内FoxP3的表达7。但FoxP3蛋白是一种细胞内蛋白，需要对细胞进行固定及穿孔后才能鉴定，因此不能用来对活的CD4+Treg细胞纯化及其在相关免疫性疾病发病机制中的研究。最新研究发现作为IL-7受体α链的CD127在Treg细胞上为弱表达（CD127low）,但在活化T细胞为高表达（CD127high)8,所有的人调节性T细胞均存在于CD4+CD25high-intCD127low群体内，该发现对精确检测机体内Treg细胞具有突破性重要价值，利用CD4、CD25抗原结合CD127三标记法检测CD4+Treg细胞既可排除活化的CD25int-lowT效应性细胞的干扰，又可以避免检测细胞核内FoxP3时必须灭活细胞缺陷，能特异性地识别调节性T细胞1。 因此本研究将CD4、CD25低CD127三者结合检测以CD4+CD25high-intCD127lowTreg T为代表的调节性T细胞在原因不明的复发性流产患者外周血中水平，结果发现，正常非孕组外周血CD4+CD25high-intCD127lowTreg T较正常妊娠组妇显著降低（P<0.01）,而复发性流产组妇女外周血CD4+CD25high-intCD127lowTreg数量较前两者增色显著降低（P均小于0.05），提示健康妇女的外周血中，存在一定数量的调节性T细胞，发挥者免疫抑制功能，并在妊娠时有扩增的趋势，从而进一步增强母体妊娠时的免疫耐受使妊娠获得成功；一旦妊娠时母体外周血中这种调节性T细胞数量因某种原因减少，母体不能或减少对胚胎半同种异体抗原发挥免疫抑制防护作用，因此最终使胚胎遭受免疫攻击而被排斥，导致流产的发生。这可能是复发性流产患者发病的重要原因之一，表明Treg在母胎免疫调节过程中发挥重要作用；另外对不明原因的复发性流产患者根据流产的次数分两组，一组小于或等于3次的反复流产患者，另一组是大于或等于4次的反复流产患者，结果发现两组患者CD4+CD25high-intCD127lowTreg细胞数量差异无统计学意义，提示，流产患者其流产次数与调节性T细胞比例降低无关。综合以上，我们认为原因不明复发性流产患者体内调节性T细胞比例下降导致了患者妊娠时的免疫耐受被打破，可能是造成原因不明复发性流产患者发病的重要原因之一。【参考文献】 1Liu WH, Putnam AL, Zhou XY, et al.CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+Treg cells.J Exp Med, 2006,203(7):1 701-1 711.2Cobbold S P, Graca L, Lin C Y, et al. Regulatory T cells in the induction and maintenance of peripheral transplantation tolerance. Transpl Int, 2003, 16(2):66-75.3Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. Immunology,1995，155(3):1 151-1 164.4Baecher-Allan C, Viglietta V, Hafler DA. Human CD4+CD25+regulatoryT cells. Semin Immunol,2004,16(2):89-98.5Brud