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mRNA差别显示技术 方玉兵09111082 生物技术二班 mRNA差别显示技术 主要内容 一 概述 mRNA差别显示技术 高等生物大约有3 5万个不同的基因 在每一个正常的体细胞中都含有相同的基因组拷贝 但在不同的组织细胞中仅有10 20 的少部分基因被选择性表达 这种选择性表达是在发育过程中细胞分化的根本原因 是调控细胞生命活动过程的核心机制 因此 比较不同组织之间 或相同组织在不同生理条件下 或胚胎在不同的发育阶段的基因表达差异 可分离并克隆出这些特异性表达的基因 近年来 该领域的研究取得了很大进展 扣除杂交 subtractivehybridization SH 基因芯片技术 DNAchiptechnique 基因表达的系统分析 serialanalysisofgeneexpression SAGE 噬菌体全套抗体库技术 phagedisplayantibodyrepertoirelibrarytechnique 和双向电泳技术 two dimensionalgelelectrophoresis 先后成功地建立 mRNA差异显示PCR技术是1992年建立起来的一种RNA指纹技术 是目前筛选差异表达基因最有效的方法 可以提供生理状态下细胞的即时信息 揭示基因调控在RNA水平的结果 它通过比较细胞对某一因素作用前后在RNA水平的差别 确定在基因水平上细胞对某些因素作用后的分子机制 二 基本概念 1992年 Liang和Padee建立了以PCR为基础的mRNA差异显示技术 differentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction DDRT PCR 它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术 目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因 2 RNA指纹 RNA首先在逆转录酶的作用下使RNA逆转录为DNA 之后以其DNA为模板 通过以DNA指纹技术建立指纹图谱进行分析 3 DNA指纹 某些DNA序列的差异可通过限制性酶切片段长度的改变反映出来 此即限制性片段长度多态性 RFLP 其主要原因是由于DNA序列个别碱基的突变而引起某个限制性内切酶识别位点的获得或丢失 表现为不同长度的酶切片段 mRNA差别显示技术 Jeffreys等用肌红蛋白基因的一个内含子的串联重复序列作探针 从人的基因文库中筛选出8个含有串联重复序列的重组克隆 序列分析表明 这8个小卫星重复单位的长度和序列不完全相同 但都有相同的核心序列 他们先后用两个小卫星探针进行Souther杂交 在低严谨条件下杂交图谱的带型千差万刷 如人的指纹一样 Jeffreys称之为DNA指纹或遗传指纹 DNA指纹图 图为41个红花檵木品种嫩叶DNA 红花檵木为我国特产的一种优良园林绿化观赏植物 DNA指纹的应用 在80年代中期兴起DNA指纹技术和RNA指纹技术 目前此技术已广泛应用于遗传育种 基因鉴定 连锁分析 罪犯鉴别 疾病早期诊断 基因调控等方面的研究 4 基因差异表达 基因表达调控的一种方式 指在对信号或诱导物做出应答时 选择表达不同的基因 或使基因的表达水平有所不同 5 基因扣除技术 也称扣除cDNA克隆 subtractivecDNAcloning 它是通过构建扣除文库 subtractivelibrary 得以实现的 本质是除去那些普遍共同存在的 或是非诱发产生的cDNA序列 从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集 提高了分离的敏感性 换句话说 也就是我们在提取低风度的mRNA或者其cDNA时是比较困难的 那么我们不用直接去提取我们的目的DNA 而是通过除去体系的其他DNA 最终达到留下我们所需DNA的目的 6 基因芯片技术 基因芯片技术也称DNA微阵列技术 DNAmicroarray 实际上就是一种大规模集成的固相杂交 是指在固相支持物上原位合成 insitusynthesis 寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面 然后与标记的样品杂交 通过对杂交信号的检测分析 得出样品的遗传信息 基因序列及表达的信息 由于常用计算机硅芯片作为固相支持物 所以称为DNA芯片 基因芯片 7 基因表达系列分析 基因表达系列分析 SAGE 是通过快速和详细分析成千上万个EST expresssequencedtags 来寻找出表达丰富度不同的SAGE标签序列 在此方法中 通过限制性酶切可以产生非常短的cDNA 10 14bp 标签 并通过PCR扩增和连接 随后对连接体进行测序 SAGE大大简化和加快了3 端表达序列标签的收集和测序 8 噬菌体抗体库技术 以噬菌体 主要是丝状噬菌体 噬菌体和T4噬菌体 为载体 将抗体基因插入噬菌体编码的外壳蛋白基因P 或P 中 在噬菌体表面以抗体 外壳蛋白融合蛋白的形成表达 经辅助病毒感染后 借助蛋白P 的信号肽穿膜作用 进入宿主外周基质 在正确折叠后被包装于噬菌体尾部 随后携带表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片段的噬菌体颗粒 此抗体可以特异性识别抗原 又能够感染宿主菌进行再扩增 将B细胞全套可变区基因克隆出来 组装成噬菌体抗体的群体 则成为噬菌体抗体库技术 9 双向电泳技术 双向电泳 two dimensionalelectrophoresis 是等电聚焦电泳和SDS PAGE 十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 的组合 即先进行等电聚焦电泳 按照pI分离 然后再进行SDS PAGE 按照分子大小 经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图 第一向进行等电聚焦 蛋白质沿pH梯度分离 至各自的等电点 随后 再沿垂直的方向进行分子量的分离 三 mRNA差异显示技术的原理 利用所有真核基因的mRNA的3 端都有一段多聚腺苷酸poly A 尾结构的特点 将不同来源的总mRNA反转录合成cDNA 此cDNA合成是采用oligo dT 12MN为引物 其中M为A C G中的任意一种 N为A C G或T中的任意一种 共有12种oligo dT 12MN引物 其中M为锚定碱基可增大引物的Tm值 N称为分类碱基 对反转录进行分类 用这12种引物分别对同一总mRNA样品进行cDNA合成 即进行12次不同的反转录反应 得到12种类型的cDNA 从而也将总mRNA分为12个亚群 在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和相应的反转录引物PCR扩增 由于扩增的cDNA片段被放射性同位素标记 因而利用放射自显影技术通过对不同组织样品的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物进行凝胶电泳分析 从而反映出不同样品间基因的时间和空间上的组织特异性的表达 mRNA差异显示技术简略流程图 放射性自显影技术的概念 放射性自显影法与普通照相的曝光 显影 定影原理相似 此法是利用放射性同位素所放出之射线使照相乳胶 感光 再经显影和定影处理 将乳胶中因受辐照而致敏的卤化银颗粒还原成金属银 洗去未 感光 的卤化银后则图像自然显示出来 图像中任何区域的黑度取决于留存的金属银的量 它反映了射线在这个区域所沉积的能量 记录 检查和测量整体和组织 细胞和亚细胞水平中放射性示踪物的分布 进行定性和半定量测定 称为放射自显影法 mRNA差别显示技术应用的优势 第一 实验要求的样品的用量较少 0 1 0 5 g 第二 因为此技术程序里包括PCR扩增步骤 因而更灵敏地用于检测在组织或细胞中表达丰度极低的mRNA样品的差异表达 第三 因为从两种或更多的特定组织样品来源的扩增产物在同一块胶上鉴定 因此能用于鉴定特定组织或细胞来源样品之间转录水平的mRNA的定性和定量变化 第四 能够检测那些彼此密切相关的RNA分子之间的表达方面的差异 而这种RNA分子的有些种类在构建消减cDNA文库时已经丢失 每种技术的诞生都不可能是完美的 mRNA差异显示技术虽然从创立时起就很受欢迎 但是许多研究者发现该技术存在一定缺陷 其中三点较为突出 第一 操作步骤多 外源DNA污染严重而导致假阳性率高 即差异片断用Northern杂交时无阳性信号 重复稳定性较差 据研究 这种假阳性率可高达70 第二 获得的差异条带短小 多为300bp左右 并且多为3 端非编码区序列 UTR 难以直接判断其功能和意义 第三 必须采用放射性同位素标记反应 使得实验周期长 成本高 易造成同位素污染 且不好回收差异片断 mRNA差别显示技术的缺陷 mRNA差异显示技术现在已经成功运用于动物的胚胎发育 组织分化 生长因子激活与抑制 细胞周期控制 癌变及疾病相关基因的鉴定和克隆 在植物无性繁殖 形态发生 次生代谢 抗逆抗病等方面被用来进行基因的鉴定 克隆以及功能研究 并取得很好的结果 概括起来其主要用途可以归纳为以下三点 第一 寻找差异表达的基因 第二 研究个体 种群或品种间转录水平上的遗传变异 第三 鉴定经济动物中控制重要数量经济性状位点的基因 四 mRNA差异显示技术的实际应用 由于人们认识的基因还不够全面 特别是对生物发生 发育及病理生理过程中某些新的功能基因和调控作用认识不足 因此差异显示技术将在研究生物进化 损伤修复 癌变及治疗反应过程中具有重要意义 差显技术的发现为在该领域中寻找新基因提供了有用的工具 相信随着不断的应用和技术的不断改善 差异显示技术必越来越多的在生命科学以及医学领