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啤酒酵母酵母菌(Saccharomyces)的分类& 在分类学上的地位 1真菌门 1子囊菌纲 1原子囊菌亚纲 1内孢霉目 1内孢霉科 1酵母亚科 1酵母属 1酿酒酵母& 人们已知的有1000多个酵母种啤酒酵母N 啤酒酵母概述及生理特性N 啤酒酵母的生活史及选育方式初步N 啤酒酵母的生产特性N 优良啤酒酵母的评估啤酒酵母概述及生理特性A分类学家进行分类时没有考虑次要差异，通常统分为啤酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae)A根据生产技术特性以及传统习惯，仍把进行啤酒生产的啤酒酵母分成两类： 8上面啤酒酵母Saccharomyces Cerevisiae 8下面啤酒酵母Saccharomyces Carlsbergensis两种啤酒酵母的主要区别两种啤酒酵母的区别-2+ 上面啤酒酵母（爱尔啤酒酵母） j具有一定的正电荷 k与带有负电荷的二氧化碳吸引形成团粒，浮力大于重力，故上浮至液面，可用撇沫法去除+ 下面啤酒酵母（贮藏啤酒酵母，lager酵母） j带有一定的负电荷 k与二氧化碳互相排斥，酵母始终悬浮于发酵液中，到达一定的发酵度时，即细胞密度达到一定时，重力大于浮力，则沉于器底啤酒酵母的生理特性F啤酒酵母的巨大菌落形态F啤酒酵母的出芽及芽痕F啤酒酵母的结构F啤酒酵母的结构 啤酒酵母的细胞壁结构 啤酒酵母的细胞膜酵母巨大菌落形态的作用*把明胶作为麦汁固化剂，比琼脂作固化剂更能增加菌落形态上的差别特征*不同的酵母在明胶麦汁平板上的形态不一 ale酵母每个菌株都具有自己特征性的菌落形态 Lager酵母不明显，更趋向于具有比较单一的形态。*主要的缺点： 为了获得特征性菌落形态，至少要在21下培养3周 不能提供有关个别菌株是否具有酿造价值的信息*这些照片能够鉴定出其它一些个性，而这些是麦芽制造者、酿造师和科学家不能提供的酵母的出芽及芽痕,酵母细胞一般以出芽方式繁殖,子细胞长到与母体一样大时，从母细胞脱落，母细胞上留下的痕迹称为“出芽痕”，子细胞上留下的痕迹称为“诞生痕”,酵母细胞壁的同一位点上只能出一次芽。通过出芽痕的数量可以知道某一细胞的出芽数量。这可以用来测量细胞的年龄,一般细胞的最多出芽次数为56次酵母细胞的细胞壁结构(酵母细胞壁是一稳固结构，维持细胞的形状与强度(细胞壁厚25nm左右，占整个细胞干重的25%(主要结构是葡聚糖和甘露聚糖，还有少量蛋白质和几丁质酵母细胞壁成份j葡聚糖&位于与质膜相邻的细胞壁内侧，形成葡聚糖层&是细胞壁的主要结构成份&去除或降解葡聚糖，将导致整个细胞壁的破坏酵母细胞壁成份k甘露聚糖E是甘露糖单体的聚合物，与蛋白质一起构成细胞壁的外围结构E去除或降解甘露聚糖，并不会破坏整个细胞壁结构E如果机械破坏细胞壁，甘露聚糖层破坏后进入啤酒中，则会造成过滤不清的混浊E甘露聚糖蛋白还会影响啤酒酵母的絮凝性酵母细胞壁成份l几丁质E几丁质是N-乙酰葡萄糖胺为单体的聚合物E构成细胞壁的最外层纤维层E与出芽痕有关，主要位于出芽痕的四周酵母细胞壁结构m蛋白质E占细胞壁干重的10%E有一部分是与细胞壁相连的酶，如葡聚糖酶，甘露聚糖酶等E这些酶具有“软化”细胞壁的功能，从而允许芽的形成酵母细胞壁对啤酒酿造的影响1细胞强壮时，酵母细胞壁结构紧密，胞内大分子物质无法进入啤酒中1细胞衰老、发生自溶、或受机械（及酶制剂）的处理后，细胞壁结构被破坏，通透性增加（壁上出现多处孔洞），则许多胞内大分子（水解酶类、蛋白质等）进入啤酒，造成啤酒混浊以及泡沫性能降低（尤其是纯生啤酒）1有时利用酵母泥pH与啤酒pH的差值测定酵母的活力如何酵母细胞膜的作用$在细胞壁内部，是一半透性膜$能够摄取周围环境的小分子营养物质，同时把胞内的代谢产物排出体外$酵母的絮凝性与细胞膜的组成有关$细胞膜受到损伤后，对于染料的通透性也会增加，因此有时根据次甲基兰染色测定死亡率时，有较大的偏差啤酒酵母生活史及选育&啤酒酵母的繁殖有无性和有性两种方式&大部分情况下，啤酒酵母进行无性繁殖，以芽殖的方式传代&在人为控制的条件下，也可以进行有性繁殖可以进行细胞杂交啤酒酵母的无性繁殖周期啤酒酵母的生长几乎完全伴随着芽的生长在快速生长的酵母培养物中，芽的形成占据整个细胞周期，所有细胞上都可以观察芽的存在。在生长很慢的酵母培养物中，可以看到不带芽的细胞，芽的形成仅占据细胞周期的部分时间通常酵母的细胞周期被定义为一次细胞分裂结束到另一次细胞分裂之间的这一阶段细胞周期的四个阶段.可以分成G1、S、G2和M期.S期是DNA开始合成的时期.M期是有丝分裂期，染色体分开并分离 .G1期代表界于有丝分裂期与DNA合成期之间的这一时期. G2期代表界于DNA合成期与有丝分裂期之间的这一时期啤酒酵母的有性繁殖周期啤酒酵母有性繁殖+要进行有性繁殖，必须先形成单倍体的子囊孢子+啤酒酵母只有在营养极度缺乏的情况下才会形成子囊孢子+一般情况下野生酵母比培养酵母易形成子囊孢子呼吸缺陷型突变菌株R呼吸缺陷型或“小”突变是啤酒酵母中最常出现的突变形式R由于酵母线粒体DNA片段缺失，形成有缺陷的线粒体基因组，突变的线粒体不能正常合成某种蛋白质。突变株通常比呼吸正常的普通菌株的菌落(也叫大菌落)要小很多R发生频率通常为群体数量的0.5%5%,但有时高达50%R许多表现型，比如糖的摄取、代谢副产物的形成、对乙醇和温度等胁迫因子的耐受性等发生变化。R细胞絮凝性、细胞壁和质膜结构以及细胞形态等也受到影响啤酒酵母呼吸缺陷型的影响呼吸缺陷型酵母或具有大量呼吸缺陷型酵母的培养物发酵的啤酒往往具有风味缺陷和发酵上的问题，表现在： 双乙酰、高级醇的含量偏高 麦汁发酵速率下降 死亡细胞数升高 酵母细胞数和絮凝能力降低啤酒酵母生产菌株的呼吸缺陷型要求果糖蔗糖麦芽糖麦芽三糖&酵母有编码a-葡萄糖苷酶(MAL S)，麦芽糖透性酶(MAL T)以及同时调节上述基因表达激活子(MAL R)的基因。MAL S 和MAL T的表达调控受麦芽糖的诱导，葡萄糖的阻遏 &当葡萄糖浓度高于1%(w/v)时，MAL基因表达受到阻遏。麦汁中的葡萄糖是影响麦汁发酵速率的主要因素 &以不能被酵母利用的葡萄糖结构类似物2-脱氧葡萄糖作抗性筛子，筛选出自发突变的变异株，可以解除葡萄糖对麦芽糖摄取的阻遏效应。提高麦汁发酵速率葡萄糖在细胞体内的去处$首先通过EMP途径形成丙酮酸，然后分成两路： $进行呼吸作用，细胞数量极剧增加，产生生物能量消耗葡萄糖的速度较快 $进行发酵，细胞数量增加很少，产生大量的代谢副产物消耗葡萄糖的速度慢得多酵母的碳代谢调控E有氧气存在下，呼吸酶体系占主导，酵母进行呼吸作用巴斯德效应E葡萄糖浓度很高时，即使有氧气存在，也是发酵酶体系占主导，酵母进行发酵代谢，即发酵抑制呼吸反巴斯德效应（Crabtree效应)E麦芽糖和麦芽三糖对呼吸没有抑制作用b.酵母细胞对氮的吸收与代谢+酵母必须从麦汁中吸收一定的氨基酸(转氨基作用)合成自身的蛋白质骨架及核酸类等含氮物质+对氨基酸的吸收有一定的顺序+氨基酸谱的组成会影响啤酒的风味氨基酸的先后利用顺序酵母对氮的代谢调控%酵母摄取氨基酸的调控机制十分复杂，包括某些特异的氨基酸载体以及具有广谱底物特异性的氨基酸透性酶。%麦汁中氮的利用受到透性酶的种类、特异性以及酵母体内氨基酸组成的反馈抑制等因素的调控%啤酒发酵过程中不利用脯氨酸，但在氧气和线粒体氧化酶存在下，当其它氨基酸被消耗完后，也能同化脯氨酸影响啤酒风味的氨基酸谱氨酸酸组成对啤酒风味的影响第一组氨基酸可以直接从麦汁中吸收，或在发酵后期由糖代谢及转氨基作用合成 第二组氨基酸的缺乏，对成品啤酒质量造成直接影响，高级醇过高大约有110种有机酸和短链、中链脂肪酸部分来源于麦芽和麦汁组分，大部分由酵母代谢产生一般用pH和总酸表示，太高会粗糙，酸露头啤酒中各种酸的种类及浓度如何，直接影响啤酒的风味与口味草酸甚至会影响啤酒的非生物稳定性2.高级醇?所有酒类共有的发酵副产物，也称“杂醇”(油)?与氮代谢有极为紧密的关系?与乙醇有一合适的比例，即500：1?主要是丙醇、丁醇、戊醇、异戊醇、苯丙醇等?高级醇的产生与酵母的生长呈线性相关性高级醇的产生途径1高级醇可以在分解途径中产生 通过氨基酸的转氨基作用形成 氨基酸含量较高时往往这样形成高级醇1高级醇也可以在合成途径中形成 通过合成过多的酮酸，再形成高级醇 氨基酸含量不足时往往这样形成高级醇1在发酵的不同阶段，由两条途径产生的高级醇比例也不同3.酯.酯是重要的风味化合物，赋予啤酒、葡萄酒以及白酒以花或水果样的香气和风味；适量存在可以接受，但控制不当导致含量不适时，会给啤酒带来令人不能接受的酯香味.乙醇或长链醇与脂肪酰基辅酶A发生反应生成酯.在啤酒中共检测出约90种不同的酯.较为重要的酯包括乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、己酸乙酯、2-乙酸苯乙酯等 影响酯含量的因素*酵母菌株的产酯特性*发酵温度（+）*发酵方式（连续分批）*接种量（-） *麦汁充氧（-）*麦汁浓度（+）*麦汁组成中C：N比太高，造成碳会合成过多的乙酰CoA（酯的前体），从而使酯含量升高4.羰基化合物&约有200种羰基化合物与啤酒及其它酒精饮的和风味有关&能影响啤酒风味的羰基化合物主要是各种醛类化合物和连二酮(VDK)，最显著的是双乙酰&羰基化合物对啤酒的风味稳定性有显著影响。过量的羰基化合物会给啤酒带来老化风味。醛类化合物会给啤酒带来青草味(丙醇、2-甲基丁醇、戊醇)以及纸板味(反-2-壬烯醛、糠醛）。5.含硫化合物K硫化氢臭鸡蛋味，适量时表现为新鲜味K二氧化硫燃烧的火柴味K二甲基硫煮熟的蔬菜味、玉米味啤酒中游离SO2的作用M SO2在酿酒过程中能起到杀菌、澄清、溶解、增酸和抗氧化的作用MSO2是有毒无色气体，具有窒息性气味，使人呼吸困难，毒害肺部器官，可引起支气管炎、肺炎M美国人认为SO2能诱发歇斯底里症 啤酒中SO2的来源#原料麦芽、发霉大米、酒花、酿造用水#生产工艺糖化或发酵过程中添加亚硫酸盐或偏重亚硫酸钾等抗氧化剂#为了提高啤酒的抗老化能力，添加过量的抗氧化剂，造成啤酒中游离SO2含量过高啤酒中游离SO2的含量指标&根据国家发酵酒卫生标准，游离SO2的含量要求50mg/L&美国要求游离SO2含量10mg/L&我国绿色食品啤酒标准要求游离SO2含量15mg/L啤酒酵母的絮凝性& “絮凝”是指“在培养基中，酵母细胞从悬浮状态或漂浮于培养基表面的状态下聚集成团或沉降下来的现象”&絮凝通常发生在酵母细胞分裂停止以后，如酵母细胞絮凝发生在对数生长后期或平衡期&酵母的絮凝性是啤酒酵母的重要生产特性，是生产能否顺利进行的重要因素啤酒酵母絮凝机制的几种假说细胞壁的阴离子成分与Ca2+相连，这些阴离子组分是蛋白质。絮凝酵母上特异性的甘露糖蛋白在交联的细胞之间以类似外源凝集素的方式作用，钙离子通过结构变化作为配基促进絮凝较受赞同“共絮凝”现象：两株不絮凝的菌株培养物混合在一起时会发生絮凝现象（只在上面啤酒酵母之间发现过）第三种形式酵母菌株可以与污染的细菌一起絮凝下来（也只在上面酵母中发现 ） 啤酒酵母絮凝机制&絮凝的发生需要有细胞表面蛋白和甘露糖受体的存在。如果被掩盖、阻碍、抑制或变性等，就不能发生絮凝现象&理想的啤酒酵母菌株应在发酵末期糖耗尽之前保持单细胞悬浮状态。随后能迅速从悬浮状态絮凝下来 &细胞絮凝激活或结束细胞处于非絮凝状态的信号是什么？这至今仍是一个许多学者孜孜以求但仍无法回答的问题 啤酒酵母的保藏方式M低温(-70或液氮)M冻干M蒸馏水保藏M油保藏M从培养基上连续转接(每两星期转接一次，共进行了两年)M在固体营养培养基上于21长期保存(每六个月转接一次)M在固体营养培养基上于4长期保存(每六个月转接一次)啤酒酵母保藏方式的评估*酵母长期保藏不仅需要最佳的细胞存活量，而且应保证酵母自身性质不发生变化*采用各种方式保藏两年后，检测各种指标，与未保藏的对照菌株进行比较 麦汁发酵速率 麦汁中糖摄取效率 絮凝性能 发芽能力 呼吸缺陷型的形成以及复活率酵母保藏方式的选择&-70保藏的酵母致死率最低且最容易活化。絮凝性能、麦汁发酵能力、孢子形成能力以及呼吸缺陷型变异株的生成比例也没有受到影响&营养琼脂斜面4保藏，每六个月转接一次的方法次之。&固体培养基21 保藏，每六个月转接一次的常规方法最不好，但是最为经济保藏方法 &应绝对避免啤酒酵母的冻干保藏 啤酒酵母的接种7酵母接种受麦汁浓度、麦汁组成、温度、麦汁充氧程度以及酵母前次使用等影响7尽可能减少酵母生长的迟滞期，尽快进入发酵状态，阻碍细菌的生长7接种量在520106个细胞/ml之间(依赖于原麦汁浓度)。考虑到诸多因素，最适接种量在1012106个细胞/ml左右7无论最初接种量如何，酵母细胞在某一特定环境下，增殖量在单位体积内只能达到某一特定值啤酒酵母的接种下面啤酒发酵中，由理论和经验可以概括为：& 每1度麦汁发酵需接种密度为1106个/mL，但不低于8106个/mL；& 每1度麦汁主发酵最高温度为1，但不低于8；& 每1度麦汁发酵麦汁溶氧水平为1mg/L，但不低于8mg/L；酵母在发酵中增殖遵循：M=Z02n式中：M-发酵中酵母最高密度； Z0接种活细胞密度； n增殖级数。 & 理论上认为，为了控制发酵代谢副产物（如高级醇和醛类）不产生过多，应控制n24h），在接种前需提前23h对酵母储罐进行通风，使酵母复苏，形成芽尖，接种后起酵速率不会降低。 3酵母泥的酸洗& 目前大生产的技术和控制水平还很难做到发酵液中绝对无杂菌，多数厂家排放3代以后的酵母泥的杂菌大多在102103个，这样的酵母泥如不经过酸洗处理，已不再适合作种酵母，尤其在酿制纯生啤酒时，3代以后的酵母应当废弃。& 酵母泥的酸洗处理就是在从酵母回收罐泵出冷却的酵母泥中用定量泵添加稀磷酸（5%），调节酵母泥pH2.83.0，维持2h后立即使用，如果加磷酸时再添加50mg/L的Nisen效果会更好，可杀灭酵母泥中90%的污染细菌。罐内pH会随着存放时间延长而升高，不许进一步调节。 1酵母泥的pH值& 酵母体内平衡的pH为6.57.0，发酵后期发酵液的pH为4.24.4，如果酵母体内物质渗漏会使酵母外围发酵液pH升高，胞内物质渗漏越多，pH升高越大，采用pH大小可以反映酵母胞壁渗漏程度。pH的测定方法如下：先测啤酒pH1，如=4.2，再取此啤酒的酵母，用6000r/min离心10min后，酵母形成泥状，分离澄清的啤酒，再测此澄清后的啤酒的pH2，则pH= pH2-pH1。& pH在0.10.3，表示正常或接近正常，此酵母泥可以作为种酵母；pH在0.30.5，表示已泄露，但不严重，此酵母泥尚可作种酵母；pH在0.51.0，表示泄露严重，风味改变大，应废弃此酵母。 2酵母细胞壁结构：酵母细胞壁外层和中层的甘露聚糖、-葡聚糖很易脱落（大剪切力输送酵母泥也会引起脱落），使酵母泥变得粘稠，进入啤酒会增加啤酒的雾浊，过滤困难。3酵母的吸附：酵母在发酵时会吸收a-酸和多酚，在壁膜间积累并氨化和聚合，若氧化a-酸和聚酚泄漏进入啤酒，会增加啤酒不愉快后苦味和涩味。4胞内脂肪泄漏会降低啤酒的泡持性。5胞内长链脂肪酸泄漏，氧化后就形成啤酒的老化味。6胞内H2S很容易泄漏，只要啤酒中达到50 ng/L，就会形成酵母臭。 7胞内含氮物质常以高肽泄漏，降低啤酒非生物稳定性。8胞内蛋白酶A和肽结合没有活性，在泄漏时肽会脱落，形成活性很强的蛋白酶A，它在啤酒中切割泡沫蛋白，使泡沫活性变差。单罐酿造超长时间贮酒（如大于2月），或纯生啤酒装瓶后超过1个月，啤酒泡持性会变得很差。但在经过热消毒的啤酒，蛋白酶A在58以上就开始钝化，丧失活性。9胞内贮存肝糖（主要是海藻糖）泄漏，会使啤酒碘值不正常，有时可达0.30.4，使啤酒非生物稳定性变差。 总结 总之，成也酵母，败也酵母。因此，不论酿造何类型的啤酒，在双乙酰还原结束后，贮酒期降低酵母死亡、自溶，酒温越底越好，分离酵母泥越彻底越好，这样才能保证酿造啤酒有纯正优良的风味。 啤酒酵母的活性与活力k酵母的活性(生存能力)定义为样品中活细胞的比例k酵母的活力定义为酵母活动的量度或发酵性能，即强壮酵母的比例k有许多标准可用来评估酵母细胞活性和活力。同一酵母样品所测得的活性会因所选的标准不同而不同。有时同时测定这两个参数来了解酵母的生理状态 特殊染色法$次甲基兰是用于酵母细胞活性染色的常用染料之一。活细胞能够降解这种染料，从而在显微镜下观察时细胞呈无色，而死细胞由于不能还原该染料而被其染为深兰色$但是对于次甲基兰无法正确检测酵母的活力$使用适当的缓冲液以及次甲基紫，能较为准确的测定细胞的活性；其它染料还有苯胺蓝$还可以用荧光染色方法评估酵母细胞的活性与活力电容测定法该方法的原理是应用活细胞膜内电荷累积形成电容。死细胞不能够产生这种电容。酵母活细胞的生物量与电容之间存在着线性关系 指示活性的繁殖能力测试法%载玻片培养利用酵母的增殖测定酵母活性%将一小滴酵母培养物置于载玻片上的营养琼脂膜上培养约18小时后，显微观察形成的微克隆%能够形成微克隆的单细胞被认为有活性，比平板计数法花的时间少得多，但比起染色法来，仍然要花费很多时间%在测定较低的酵母细胞活性时具有较高的精确度 酸化力法(由Opekarova和Sigler两人建立(添加葡萄糖后，测定悬浮的酵母细胞体外pH值的下降。(该方法在检测酵母代谢活力有较大差别时很有效(需要酵母样品进行彻底洗涤，且样品数量要多胞内pH值法(ICP)?ICP法是利用一种pH敏感的荧光物质检测单个细胞或细胞群体内的胞内pH?活跃酵母细胞的胞内pH并不因环境pH的下降而下降，但活力下降的细胞则会由于外界pH的下降而导致胞内pH的下降?该方法比酸化力法更敏感，能检测出酵母细胞活力的细微变化?需要价格非常昂贵的仪器酵母活力的胁迫应答测定法3酵母活力可以认为是酵母活动或发酵性能的量度，也定义为酵母细胞忍受或克服胁迫条件的能力3因而可以将细胞活力和酵母细胞对胁迫因子，如乙醇、热