「小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验 形态学实验报告」.doc

小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验XXX大学XX医学院XX级 XXXX班 XXX指导老师：XXX 【摘要】目的1.建立小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系HCaF细胞模型，对肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性有所认识；2.进一步了解动物尸体解剖、组织取材、染色的过程；3.强化科研思维的培养和实验技能的训练。方法将小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移细胞株(HCaF经615小鼠左侧足垫接种的方法获得淋巴结转移瘤1代细胞HCaPL，再经小鼠淋巴系统筛选5次，筛选高转移细胞系HCaF。结果观察记录28天，20只全部存活,未见明显的淋巴结肿大或肿瘤形成，其他组织器官未发现肉眼可见异常。镜下可见淋巴结中肿瘤细胞异型性明显。结论可移植性小鼠腹水癌经淋巴道向其他部位发生转移。【Abstract】Establishment of mouse ascitichepatoma lymphatic metastatic cell line HCa - F cell model. Methods To murine ascitichepatoma lymphatic metastasis cell lines ( HCa - F 615 mouse left foot subcutaneous inoculation method for obtaining lymph nodesRadioactive seed 1 generation cell HCa - F, and then by murine lymphatic system screening 5, screening high metastatic cell line HCa F.ResultsObservation record of 28 days; 5 survived not to form tumors in other organs revealed no abnormalities.but the atypia of the tumor cell can observed in lymph node in light microscope.ConclusionsPortability mice ascties cancer via the lymphatic way to other parts of the shift.【关键词】小鼠腹水型肝癌细胞株（HCa-F）; 615小鼠淋巴道转移【Keywords】murine ascitic hepatocarcinoma cell strain （HCa-F）; metastasis前言：转移是恶性肿瘤的最重要标志和最本质表现，也是肿瘤所致患者死亡的最主要原因。早期发现并防止肿瘤转移是改善病人预后的重要手段。因此，肿瘤转移机制及防治已成为当今肿瘤研究领域的热点。H22肿瘤瘤株属小鼠的肝细胞瘤,系1952年苏联医学科学院肿瘤研究院(莫斯科)用O-Ptoaminoa-zotolyol(OAAT)涂C3H小鼠的皮肤100次后诱发,皮下传代的肝脏实体瘤。1963年中科院上海药物所引进后将肝脏实体型瘤株变成腹水型瘤株(其腹水型又称Hca,HAC或HepA),被广泛应用于肿瘤淋巴道转移机制研究及药物筛选。它们经615 小鼠局部皮下注射后，特异地向引流淋巴结转移。此实验通过建立小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系HCaF细胞模型，对肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性有所认识。了解肿瘤淋巴道转移。研究姜黄素对小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移细胞株(HCa-F)生长和转移行为的影响。方法体外实验中用15250mol/L姜黄素分别处理HCa-F细胞48h,以MTT法检测HCa-F细胞的生长活性;以生长曲线评估姜黄素对细胞增殖的影响;以流式细胞仪检测姜黄素对细胞周期分布的影响。体内实验中,于615小鼠腹腔、足垫接种HCa-F细胞,通过ip给药的方法,观察姜黄素对腹腔接种HCa-F细胞的615小鼠生存率的影响和对HCa-F细胞在615小鼠淋巴道转移的影响。结果姜黄素可抑制HCa-F细胞的生长,对HCa-F细胞生长抑制率为7。23%82。23%,呈剂量依赖性,IC50为51。48mol/L。以非细胞毒性最大剂量15mol/L姜黄素作用48h后,HCa-F细胞的群体倍增时间增加,生长速度受到抑制,细胞周期被重新分布,阻滞于S期。姜黄素ip给药50mg/kg抑制小鼠腹水瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期,使瘤细胞淋巴道转移率从70%下降到40%。结论姜黄素可抑制小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移细胞株(HCa-F)的增殖与转移。【正文】实验材料1.研究对象（1）细胞系：高转移力小鼠腹水型肝癌细胞，由大连医科大学病理教研室建株并保存。（2）实验动物：近交系615小鼠，雌雄兼用，68周龄，体重1822g，由大连医科大学实验动物中心提供。2.主要试剂及器皿搪瓷盆、温度计、离心管、1ml注射器、手术刀、眼科手术剪、眼科手术镊、乳胶手套、生理盐水、1%来苏儿溶液、75%酒精棉、10%甲醛固定液等。研究方法1. 细胞系获取：从液氮罐中取出高转移力小鼠腹水型肝癌细胞（HCa-F）塑料冻存管，立即放入40的温水中，1分钟内使冻存液全部融化，立即送入无菌室中。取出细胞悬液放入离心管中，用生理盐水洗涤2次，离心，弃上清，再加1ml生理盐水吹打混匀。向小鼠腹腔内接种0.2ml HCa-F细胞悬液（约6106个肿瘤细胞），于第六天无菌条件取腹水。2. 615小鼠皮下接种肿瘤细胞：取615小鼠癌性腹水0.2ml，内含4106个活瘤细胞，接种于615小鼠右腋中线皮下和后右侧足垫皮下，严格消毒。选择右腋皮下，一方面便于观察瘤块的生长，另一方面该处的血液循环好，有利于瘤细胞生长。选择左足垫皮下是用于对比不同部位瘤细胞生长情况。注射针头进入皮下（真皮下），若针头能自由拔动无牵连，注入注射液后形成小泡，则是皮下无误。由于皮下组织较松，注射液很快扩散，一定时间小泡可消失。定期检查右腋和左足垫皮下肿瘤生长和同侧腋窝淋巴结及腹股沟淋巴结肿大情况，于接种后28天处死全部小鼠，取皮下瘤体及双侧有关淋巴结称重，同时观察肺、肝、肾等脏器。将上述组织固定于10%甲醛固定液中，石蜡包埋制片。HE染色，显微镜检查。3. 组织取材：将皮下瘤体、淋巴结、肺、肝、肾选取病变部位，切成厚23mm的小于2cm1cm大小的组织块，10%中性甲醛固定。小块组织一般固定数小时，较大标本需固定2448小时。经冲洗（用递升浓度的酒精等）、透明（用二甲苯等）、浸蜡（用石蜡）、然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片机切片和染色制成切片。一般常规作苏木精-伊红染色。4. 切片染色：石蜡切片法、HE染色法。（1）脱水程序及时间：组织固定，冲洗，然后：1）脱水：依下列顺序进行：60%酒精30分钟80%酒精12小时95%酒精24小时或过夜95%酒精24小时100%酒精24小时100%酒精24小时或过夜。2）透明：二甲苯3045分钟；二甲苯3045分钟。3）浸蜡：蜡碗、（各3045分钟）；包埋。4）修蜡块：修蜡块，贴号。5）切片：切片。6）烘烤：烘烤切片6070，1小时。7）染色：染色。（2）HE切片染色程序与方法1）切片脱蜡水洗（与脱水过程相反）：将烘干的切片浸入二甲苯、各510分钟（非常关键，宁长勿短，主要目的是为了将石蜡洗掉）。无水酒精310分钟（消除二甲苯）95%酒精13分钟80%酒精13分钟70%酒精13分钟50%酒精13分钟自来水冲洗5分钟以上（洗去切片上的酒精，切片透明）蒸馏水清洗（防止污染苏木精染液）。脱蜡是水化过程，目的是通过酒精的缓冲作用，易于水洗与染色。因为染液溶剂是水，从无水酒精直接放入染液中容易引起激烈的扩散作用，造成切片漂浮脱落或损伤组织。而经各级浓度酒精缓冲后即可避免发生这种现象。2）HE染色：苏木精-伊红染色是先用苏木精将组织切片适当的过染，经水洗后再用盐酸酒精分化，弱碱性水溶液显蓝。使胞核呈鲜明的蓝色，胞质及背景无色。再经水洗后用伊红染胞质，染成深浅不同程度的粉红色至红色。苏木浸染（染核）515分钟（统一时间10分钟）自来水冲洗35分钟0.5%1%盐酸酒精分化数秒钟（分化）自来水洗15分钟弱碱性水溶液显蓝3060秒（或60热水5分钟）自来水冲洗510分钟蒸馏水洗12次伊红1分钟蒸馏水洗12次。3）脱水、透明、封固：脱水、透明的目的是使存留在切片上的水分及漂浮的染色液全部处净，经透明剂的作用后，将脱水剂清除出来，使切片产生适宜的折光率。最后用盖玻片及封固剂封固，便于观察和长期保存。80%酒精3040秒95%酒精3060秒无水酒精15分钟无水酒精15分钟二甲苯15分钟二甲苯15分钟中性树胶封固。520只小鼠，其中全发生腹水型肝癌发生淋巴道转移，在各淋巴结中均可见异型性细胞，转移率为100%，但并未造成明显的相关器官发生病变。研究结果：观察记录28天；20只全部存活，取存活的小鼠肝脏和淋巴结进行检查，淋巴结及肝脏肉眼未见肿大及明显变化。其中有8只，镜下可见淋巴结内肿瘤细胞异型性明显及肿瘤病灶即癌巢，其他组织器官未发现异常。研究结论：小鼠腹水型肝癌发生淋巴道转移，转移率为40%，并可造成相关器官发生病变。【结果】1建模后饲养28天，解剖，皮下未见任何瘤样组织，淋巴结肿大，肝肾肺等组织器官未见大体明显异型性改变，镜下可见少许肿瘤细胞。2同侧腋下淋巴结：大体：与正常淋巴结相比略大，呈卵圆形，质硬，切面灰白色。：在淋巴结的边缘窦处可看到某些细胞分布不规律，细胞体积较大、形态不一，核较大，胞质蓝染，组织生长杂乱，细胞异型性明显，表明此淋巴结中的肿瘤组织是原发病灶的肿瘤经淋巴道转移的结果。3肺、肝、肾；大体：未见明显异常：可见到组织结构和细胞的异型性，组织结构被破坏，肿瘤细胞异型性明显。说明肿瘤细胞在发生淋巴道转移的同时也发生了血液转移。420只小鼠，其中全发生腹水型肝癌发生淋巴道转移，在各淋巴结中均可见异型性细胞，转移率为100%，但并未造成明显的相关器官发生病变。淋巴结（40） 淋巴结(10) 肝脏（10） 肾(10)【讨论】人体内对抗癌细胞的功能主要由免疫系统承担。免疫系统被肿瘤细胞阻塞，淋巴液就会向相反的方向流动，导致不符合常规的转移现象。血行转移：血流速度要比淋巴液流动快得多，肿瘤细胞在血管的转移速度快，来势凶猛。肿瘤细胞侵入血管的途径有： 1、癌细胞浸润血管壁（通常为小静脉）；2、通过血管破口进入血流；3、通过淋巴管进入血流：人体所有的血液首先汇集到肺内获得氧气，故血行转移的癌灶也以肺最多最早，这也是肿瘤病人都要做肺部X线检查原因。肝脏、脑、椎、体及骨的转移，一般也是血道扩散的后果。种植性转移：此种转移方式主要发生于腹腔，及胸腔，当肿瘤突破所在的胸腔器官的最外处一道防线，癌细胞可从癌体上脱落下来，撒播到其下方的脏器表面，哪里条件适合就在哪里附着，生长，繁殖。癌细胞好比种子，它附着生长的地方好比土壤，故称之为种植性转移，这种转移常伴有腹水或胸水。肿瘤转移是恶性肿瘤最基本的生物学特征，是一系列具有内在联系的多个步骤相互作用的结果，最早是Liotta提出的粘附、降解、移动学说，每个步骤也是有多个因素的共同参与，因而其具有复杂性。当前确定肿瘤转移主要是依据常规病理切片的结果，但有些患者虽进行了根治手术，且常规病理切片淋巴结无转移，但随后仍出现肿瘤转移。所以单纯根据常规病理切片。来进行预后的判断往往欠科学，因此急需发展新的手段来检测肿瘤的转移。近年来随着免疫学与分子生物学的发展，为更敏感地检测到淋巴道、血道中转移的肿瘤细胞提供可能。转移是导致大多数肿瘤患者死亡的主要原因,肿瘤转移机制及防治已成为当今重要的研究课题。Hca-F和Hca-P是一对高度同源且淋巴道转移能力显著不同的小鼠腹水型肝癌细胞,其中Hca-F为高转移细胞株,Hca-P为低转移细胞株。在本实验中观察到的肿瘤细胞的异型性准要表现在以下几个方面：1肿瘤细胞的多形性表现为瘤细胞大小不一，形态不规则，甚至出现胞体特大的瘤巨细胞。少数分化差的肿瘤细胞较相应组织的正常细胞小，圆形，且大小较一致。2核的多形性细胞核大小不一，形态不规则，甚至出现多核、巨核、畸形核瘤细胞。肿瘤细胞核明显增大，因而使核/浆比例增大，从正常的1:46增至1:1.52,甚至1:1。核染色质呈粗大颗粒状，分布不匀，常靠近核膜分布，使核膜显得增厚。核仁肥大,数目增多。核分裂像多见，并可出现病理性核分裂，即多极性、不对称性、顿挫型核分裂。恶性肿瘤细胞核多形性与染色体呈多倍体或非整倍体有关。3胞质的改变恶性肿瘤细胞的胞质一般由于分化低而减少,但有时也可以增多。由于胞质内核蛋白体增多，故多呈嗜碱性染色。而此次试验便是通过建立小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系HCaF细胞模型，对肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性有所了解。通过模型的建立，染色制片，镜检等一系列的过程建立了科研的学术观念，掌握了相关的专业知识。【参考文献】1张宏颖，刘春平，唐建武 医学形态学人民卫生出版社 20092石玉秀，组织学与胚胎学，高等教育出版社 20093 凌茂英，王明辉，郭伶伶，等.Hca/16A3-F 及Hca/16A2-P 两株小鼠淋巴道转移肝癌细胞系的特性研究，中华医学杂志，1995, 75(3):170171.4 张宏颖，刘春平;，唐建武;，许国旺等，姜黄素对小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移细胞株(HCa-F)生物