《让质粒鲜活起来》PPT课件.pptVIP

让质粒鲜活起来 生物技术102班第二小组成员 华璐 钟依依 苗舒 庄思静 章辉辉 质粒的概念 质粒是一类亚细胞有机体 结构比病毒还要简单 既没有蛋白质外壳 也没有细胞外的生命周期 却能在宿主细胞中独立地增值 并随着宿主细胞的分裂而被遗传下去 Plasmid 目录 CONTENTS 异同分析 质粒的基本性质 质粒分子的构型多样 大小不一 共价封闭环状DNA 即SC构型 开环DNA 称作OC构型 线形DNA 即L构型 1 2 3 除了酵母的杀伤质粒是一种RNA质粒外 目前发现的质粒都是以DNA方式存在的 2020 2 9 质粒的自主复制性和可扩增性 根据质粒复制与宿主菌相关程度不同 可将质粒分为严谨型质粒和松弛型质粒 常被选为基因工程载体 严谨型质粒通常是一些具有自身传递能力的大质粒 其复制与宿主菌密切相关 松弛型质粒通常是分子量较小 不具传递能力的质粒 它在宿主菌内通常可含10 200个拷贝 且不受宿主菌蛋白合成的影响 2020 2 9 质粒的可转移性 质粒的可转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性 根据是否携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因 质粒可分为接合型质粒和非接合型质粒两类 2020 2 9 质粒的不相容性 质粒的不相容性有时也称质粒的不亲和性 它是指在没有选择压力的情况下 两种亲缘关系密切的不同质粒 不能在同一个宿主细胞系中稳定共存的现象 这样的两种质粒称为不亲和质粒 2020 2 9 质粒研制与发展的三个阶段 2020 2 9 常用的几种质粒 pBR322质粒载体这是目前常规基因克隆实验中最普遍采用的载体 有万能质粒之称 pUC质粒载体它实际上是由pBR322质粒载体改造而来的一系列质粒载体的总称 它包括有pUC8 pUC9 pUC12 pUC13 pUC18等 2020 2 9 Pvu 2067 pBR322质粒载体结构图 2020 2 9 pUC18质粒载体结构图 2020 2 9 pUC系列质粒载体的优点 与pBR322质粒载体相比 pUC系列质粒载体具有许多优越性 1 具有更小的分子量和更高拷贝数 2 由于具有来自大肠杆菌lac操纵子lacZ 的基因 它所编码的 肽链可参与 互补作用 可用于组织化学方法检测重组体 3 具有多克隆位点MCS区段 2020 2 9 质粒的提取 在提出的许多用于从细菌中提纯质粒DNA的方法中都含有以下3个步骤 1 细菌培养物的生长 2 细菌的收获和裂解 3 质粒DNA的纯化 2020 2 9 提取的方法 质粒DNA的提取方法主要有 碱裂解法 此方法适用于小量质粒DNA的提取 提取的质粒DNA可直接用于酶切 PCR扩增 银染序列分析 煮沸法酚氯仿裂解法 2020 2 9 碱裂解法 1 接1 含质粒的大肠杆菌细胞于2mlLB培养基 2 37 振荡培养过夜 3 取1 5ml菌体于Ep管 以4000rpm离心3min 弃上清液 4 加0 lml溶液I 1 葡萄糖 50mM LEDTApH8 0 25mM LTris HClpH8 0 充分混合 5 加入0 2ml溶液II 0 2mM LNaOH 1 SDS 轻轻翻转混匀 置于冰浴5min 2020 2 9 6 加入0 15m1预冷溶液III 5mol LKAc pH4 8 轻轻翻转混匀 置于冰浴5min 7 以10 000rpm离心20min 取上清液于另一新Ep管8 加入等体积的异戊醇 混匀后于0 静置10min 9 再以10 000rpm离心20min 弃上清 10 用70 乙醇0 5ml洗涤一次 抽干所有液体 11 待沉淀干燥后 溶于0 05mlTE缓冲液中 2020 2 9 相关试剂的作用 一 溶液I 50mM葡萄糖 25mMTris Cl 10mMEDTA pH8 0主要作用是 调节反应液pH 使大肠杆菌悬浮于反应液中 螯合Ca2 Mg2 等二价金属离子 二 溶液II 0 2NNaOH 1 SDS主要作用是 两者共同作用 使细胞溶解 其中NaOH为主 SDS为辅 2020 2 9 三 溶液III 3M醋酸钾 2M醋酸主要作用是 使钾离子置换SDS中的钠离子而形成不溶性的PDS 同时高浓度的盐 使得沉淀更加完全 四 异戊醇主要作用是 为了让离心后上下层的界面更加清晰 也方便了水相的回收 五 乙醇主要作用是 进一步沉淀质粒DNA 去除残留的盐 2020 2 9 质粒提取 基因组提取 提取步骤基本上都属DNA的提取步骤 包括细胞裂解 DNA释放 纯化 最后沉