cDNA-AFLP详细步骤.doc

3.2.3双链cDNA的合成及精制(1).第一链cDNA的合成采用TaKaRa公司一链合成试剂盒进行，具体操作如下：在PCR管中加入下列反应成分：总RNA约5g，Oligo(dT)18（50mol/L）1L，dNTP（10 mmol/L）1L，DEPC-H2O补足10L。于65变性5 min，置于冰上2min。向上述PCR管中继续加入下列成分：5RT Buffer 4L，RNase Inhibitor（40 U/L）0.5L，M-MLV Reverse Transcriptase（5 U/L）1L，dd H2O 4.5L，总体积20L，混匀稍离心，42温浴1 h，7015 min使酶失活，直接进行第二链合成。42恒温1 h，70水浴10 min，然后置于4冷却。然后进入第二链的合成(2).第二链cDNA的合成使用DNA polymerase（TaKaRa，大连）和RNase H（TaKaRa，大连）进行，体系如下:ComponentvolumecDNA第一链10.0L反应buffer14.0LdNTP(10mM)1.5LDNA Polymerse（4U/L）3.5LRNase H（10U/L）0.2LDNA连接酶(350u/L)0.3Ldd-H2O 10.5LFinal volume40.0L轻轻混合，稍离心，PCR仪上16反应2.5 h，70终止反应10 min。加入0.4LT4DNA聚合酶，轻轻混合，PCR仪上37反应10min。加入5L 200 mmol/L EDTA终止反应。(3).双链cDNA的精制向第二链合成产物中加入50L的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液，剧烈混匀，室温12000 r/min，离心10 min。将上清转入另一离心管中，加入100L预冷（-20）的异丙醇，-20放置2 h以上。4，12000 r/min，离心15 min，弃上清，沉淀用沉淀用75的乙醇（4放置）洗两次。沉淀风干5-10 min，加入1020L的ddH2O溶解。用1.5的琼脂糖快速电泳检测，并测定OD值。-20保存备用。413.2.4 cDNA-AFLP差异显示3.2.4.1限制性酶切酶切体系参照内切酶说明书进行。(1).Taq酶切：在PCR管中加入模板cDNA约200 ng，10RL Buffer 4L，Taq酶（20u/L）0.5L，ddH2O补足40L，混匀，稍离心，65反应2 h。(2).Ase酶切：在上述管中继续加入以下成分：10RL Buffer 2L，Ase酶（20u/L）0.5L，ddH2O 7.5L，总体积50L，混匀，稍离心，37反应2 h。3.2.4.2接头连接向酶切产物中继续加入下列成分：Taq接头（25pM）2L，Ase接头（5pM）1L，ATP(10mM)0.5L，T4 DNA Ligase Buffer 0.5L，T4 DNA Ligase(350u/L)0.2L，ddH2O 0.8L，总体积55L，混匀，稍离心，37，3h。连接反应结束后于-20保存。注：Taq接头分别由T1和T2等莫尔浓度配制，Ase接头分别由A1和A2等莫尔浓度配制.3.2.4.3预扩增预扩增体系为：Component volumecDNA酶切连接产物5.0L10PCR buffer 2.0LMg2+(25mM)2.0LdNTP(10mM)0.5L预扩引物A3（20M）1.0L预扩引物T3（20M）1.0LTaq DNA Polymerase(5U/L)0.15LddH2O 8.35LFinal volume 20L混匀，稍离心，进行PCR扩增反应。扩增程序为942min；9430s，5630s，7260s，共25个循环；7210min。结果取5L，用1.0的琼脂糖检测。3.2.4.4选择性扩增预扩增产物稀释20后进行选择性扩增，其体系为：42Component volume20稀释的预扩增产物2.0L10PCR buffer 2.0LMg2+(25mM)2.0LdNTP(10mM)0.5L选扩引物A（20M）1.0L选扩引物T（20M）1.0LTaq DNA Polymerase(5U/L)0.2LddH2O 11.3LFinal volume 20.0L混匀，稍离心，进行PCR扩增反应，扩增程序为942min；9430s，65（每循环降低0.7）30s，7260s，共12个循环；9430s，5630s，721min共23个循环；7210min。共用16个A引物和16个T引物，组成256对引物组合对所有材料分别进行cDNA-AFLP差异显示分析。3.2.4.5聚丙烯凝胶电泳分析电泳分析采用20 cm20 cm的竖直板电泳槽进行。非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度6.0%，电泳液为1TBE。电泳参数：恒压280 V。上样量4.0L，分子量marker稀释3后上样2.0L。电泳完毕，剥胶，进行银染分析，具体操作如下：(1).将凝胶于300 mL固定液（2乙酸，0.1%冰乙酸）中固定10min；(2).在0.2%的硝酸银渗透液中渗透30s；(3).蒸馏水漂洗30s；(4).0.002%的硫代硫酸钠水溶液中漂洗30s；(5).在显色液（1.5%NaOH，0.4甲醛）中显色至条带清晰；(6).自来水冲洗照相，以做分析。3.2.4.6差异片段的聚丙烯酰胺凝胶回收与再扩增在差异条带的对应位置用干净的刀片切取条带置离心管中，加100L ddH2O于55下温浴30min，-204h或过夜。沸水浴15min，然后稍离心，上清转入新离心管，加入等体积的异丙醇（-20预冷）沉淀DNA。4，12000 r/min离心15min，用75%乙醇洗沉淀，将沉淀风干5-10 min，最后溶于20L ddH2O。取5L回收产物做模板，用原选扩引物及体系再次进行扩增。为增加回收产物的量，可将原反应体系依比例扩大。扩增程序为942min；9430s，5630s，7260s，共35个循环；7210min。再扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，并用胶回收试剂盒（天根公司）进行片段回收，具体方法如下：(1).切取含目的DNA片段的凝胶薄片，并向离心管中加入600L溶胶液PN，50oC温育约10min直至凝胶完全熔化，期间间断振荡混合几次；(2).柱子平衡：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500L平衡液BL，12000 rpm离心1 min，到掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(3).将胶溶解液温度降至室温后，加入上述平衡过的吸附柱中，室温放置2 min，12000rpm离心45s，到掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；(4).向吸附柱CA2中加入700L漂洗液PW，12000 rpm离心45s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(5).向吸附柱CA