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STR片段分析技术相关知识 肖怀东FieldApplicationSpecialistTel 4008208982 8008208982E mail CNAPMsupport 摘要 基本概念回顾片段分析技术原理及过程常见影响分型因素 基本概念回顾 基本概念回顾 基本概念 染色体 DNA 基因 遗传标记 等位基因等分子遗传标记的发展STR概念及相关特性 双链DNA Gene 基因 能够表达出特定功能的产物 并决定生物体特定性状的一段DNA序列 常用术语 染色体 DNA的组装形式 每个人体细胞含有23对染色体 常用术语 能够稳定遗传的任何分子特征个体间有显著差异且易于检测可位于染色体的任意位置 遗传标记 GeneticMarker 常用术语 基因座 遗传标记在染色体上的位置 同源染色体 成对的两条染色体互称为同源染色体 等位基因 在同源染色体上占据相同座位上的一对等位基因 D2S118 多态性 Polymorphism 序列多态性 DNA在序列上的变异长度多态性 AGACTAGACATT AGATTAGGCATT AATG AATG AATG 2repeats 3repeats AATG AATG 常用术语 分子遗传标记的发展 Ifyouwanttounderstandtoday youhavetosearchyesterday AttributedtoPearlBuck TheNobelPrizeinLiterature1938 PearlBuck 分子遗传标记的发展 1985 1990 1994 1998 2000 2002 1992 2006 1996 2004 2010 2008 2013 RFLP SNP PCR首次描述 2012 1991 STR 第一个商业化荧光复合STR试剂盒 PCR应用于办案 CODISlocidefined UKNationalDatabaselaunched April10 1995 STR成为常规使用 Identifiler5 dyekitandABI3100首个Y STR试剂盒 miniSTR IdentifilerDirectIdentifilerPlus 3500 xl Y DirectGlobalFiler PGM CODISupdate 参考Bulter ForensicDNAtyping 什么是STR 短串联重复序列 Shorttandemrepeat STR 微卫星DNA microsatelliteDNA 简单重复序列 simplesequencerepeat SSR 长度多态性遗传标记 一般由2 6个碱基的DNA重复序列组成 其长度多态性来源于重复单位拷贝数的个体差异 常用术语 DinucleotideTrinucleotideTetranucleotidePentanucleotideHexanucleotide CA CA CA CA GCC GCC GCC AATG AATG AATG AGAAA AGAAA AGTACA AGTACA 5 TCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAGATCAATACAGACAGAAGACAGGTGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATCATTGAAAGACAAAACAGAGATGGATGATAGATACATGCTTACAGATGCACAC3 12GATArepeats 12 isallthatisreported Thenumberofconsecutiverepeatunitscanvarybetweenpeople CategoriesforSTRMarkers ThesecategorieswerefirstdescribedbyUrquhartetal 1994 Int J LegalMed 107 13 20 适用于法医DNA分型的STR基因座的选择 较高的个体识别率 通常 0 9 观测杂合度 0 7在染色体上定位相对较远 确保无连锁低stutter产物 低突变率与其他遗传标记复合检测时易于得到结果 且具有重现性鉴定的位点越多 判错的可能性越小 个体识别能力越来越强 统计学基本概念 遗传多态性指控制遗传标记的基因座上存在有两个或两个以上的等位基因 并且等位基因的频率大于0 01 基因频率 等位基因频率指某种等位基因数目占该等位基因上所有等位基因总数目的百分比杂合度 heterozygosity 是一个传统的遗传学指标 指群体中某遗传标记所有基因型中杂合子所占的比例 个人识别率 ProbabiltyofDiscriminationpower PD 在群体中随机抽取两个体 二者的遗传标记表型不同的概率 CSF1PO D5S818 D21S11 TH01 TPOX D13S317 D7S820 D16S539 D18S51 D8S1179 D3S1358 FGA VWA 13CODISCoreSTRLoci 法医学应用的STR在染色体上的位置 CoreSTRLocifortheUnitedStates 1997 SE33 23 D2S1338 D19S433 D1S1656 D12S391 DYS391 STR的特性 分布广泛 有高度多态性 检测方法简单 扩增片段短 适用于降解 陈旧和腐败检材的分型鉴定 复合扩增 可以实现自动化操作 节约时间 节约检材 提高检测效率 目前 STR已广泛应用于遗传制图 连锁分析 亲子鉴定 个体识别 疾病基因定位和物种多态性研究等领域 常用术语 片段分析技术原理及过程 STR片段分析的原理 除同卵双生外 每个人 生物包含的DNA序列是不同的 独一无二的同一个个体的各种组织DNA具有相同的序列特征 如同一个人来自皮肤的DNA和血液的DNA是一样的 相匹配的 同一个个体的DNA序列在一生当中保持不变 除外某些疾病 同一个个体的DNA一半来自母亲 一半来自父亲 样本采集 样本制备 样本提取 FLOQSwab PrepFilerExpress PrepFilerExpress BTA AutoMateExpress 扩增 检测 数据分析 STR片段分析的过程 定量 7500 HIDRealTimePCRAnalysisSoftware STR片段分析的过程 样本采集 FLOQSwab 生物物证的采集 DNA是否能开展应用 现场采集至关很重要直接提取转移提取 擦拭 粘取 吸取等 FibreSwab FLOQSwab 生物物证的采集 DNA是否能开展应用 现场采集至关很重要直接提取转移提取 擦拭 粘取 吸取等单细胞捕获 ArcturusXT LCM 生物物证的采集 DNA是否能开展应用 现场采集至关很重要采集工具 介质无人类DNA DNA酶和RNA酶高效收集 最大量 操作简便 无人体侵害性转移步骤少可自动化 易存储 BodeBuccalCollector CopanNUCLEICard System STR片段分析的过程 样本制备 样本提取 样本制备 利于峰均衡性利于得到好的峰高利于减少杂峰用于口腔拭子和未经处理的采集卡 Prep n Go Buffer BSD及打孔 bsdtechsupport 使用PrepFiler Express 试剂盒 专用于法医样品提取 以获得高质量DNA 使用简单 可靠 操作时系统密闭 避免污染 30分钟内可同时处理13个样本 使用LySep柱简化了裂解过程 提取的DNA完整 无抑制物 针对定量和片段分析试剂盒进行了验证 样本提取 STR片段分析的过程 定量 定量 准确的定量在法医DNA检测过程中至关重要过多的DNA会导致off scale峰 分裂峰 由于noise或 A 滑移峰和其他颜色的渗透峰 过少的DNA导致位点丢失 峰高不平衡指导后续试验选择试剂盒 DNASize bp Wegenerallyshootfor0 5 2ng 定量 仪器7500定量试剂盒的选择Quantifiler HumanDNAQuantificationKitQuantifiler YHumanMaleDNAQuantificationKitQuantifiler DuoDNAQuantificationkit STR片段分析的过程 扩增 扩增 PCR是什么 PolymeraseChainReactionPCR的应用有哪些 个人识别和亲权鉴定 传染病诊断 快速分子诊断 动物健康与食品安全PCR的过程PCR反应组分PCR反应影响因素 PCR过程示意图 STR片段分析的过程 电泳检测 不同长短的片段可以通过电泳分离相同长短的片段可以通过不同颜色来区分 电泳检测 STR片段分析的过程 数据分析 数据分析 1 片段分析 GeneScan 分子量内标 LIZ500 的作用 已知长度的片段作分子量标准 可以得到长度对迁移时间的标准曲线 测定出未知样品的迁移时间 与标准曲线相比较后 计算出未知片段长度 这就是片段分析 GeneScan 生成标准曲线 判定未知片段大小 迁移时间 115 75 未知片段 片段长度 75 100 t1 t2 t3 139 数据分析 2 基因分型 Genotyping 样品峰与ladder比对 自动判定等位基因 常见影响分析因素 正常的STR图谱 理想的峰型 具有良好分型的峰特征 尖锐光滑对称落在bin内 且被软件标注正确分型无肩膀峰或者分裂峰 常见分析因素 Stutter 影子峰 滑移峰 DNA聚合酶滑脱产物 Splitpeak 分裂峰 or加A不全 非模板依赖添加 NullAllele等位基因缺失 无效等位基因突变 三等位基因 亲权鉴定观察到的突变 微变异 1 Stutter 也叫影子带 或DNA聚合酶滑脱产物 stutter Stutter产生机理 机理 链滑脱错配机制 在引物延伸过程中 引物链或模板链滑脱 导致一个重复单位形成的碱基非配对环 模板DNA 扩增产物 扩增产物 扩增产物 扩增产物 模板DNA 模板DNA 模板DNA Stutter特点 Stutter峰比相应等位基因峰小一个重复单位 极少出现多一个重复单位的峰 是混合样品还是stutter Stutterregion 9 a b 100 100 Stutter具有基因座特异性Stutter具有试剂盒特异性 Stutter对样本分析造成的困扰 Stutter产物的解决 主要通过改进Mix的配方来减少滑移峰采用标准反应体系及扩增程序使用适当量的DNA Identifiler推荐模板量0 5 1 0ng 2 非模板添加 加A峰 特点 比正常产物多一个A原理 所有的Taq酶本身都有加A效应 非模板添加 加A峰产生的原因 加入模板DNA过多没有足够的时间给所有的产物都加A没有足够的酶量加A扩增的参数设置不正确延伸时间不充分酶少或者变质反应体系变化 减小或者改变 PCR仪有问题 非模板添加 加A峰对样本分析造成的困扰 峰型变宽影响潜在的微变异的准确分型 A A 非模板添加 加A不全的解决 加A方法 全部转换成 A全部转换成 A引物进行修饰 引物带一段不同源的尾巴 尾巴促使加A 采用标准的扩增程序采用推荐的DNA量采用标准的反应体系 A 在DNA模板存在 但由于在PCR过程中的引物结合问题导致扩增失败的等位基因 Amelogenin D22S1045 D2S441 3 无效等位基因 NullAlleles 无效等位基因 NullAlleles 产生的机理 8 8 6 6 8 Allele6ampliconhas droppedout Imbalanceinallelepeakheights Heterozygousallelesarewellbalanced 引物区突变 杂合子 被 纯合子不同的PCR引物扩增相同样本 得到不同的结果影响DNA数据库的比对结果 出现假阴性结果或者相同来源的两个样本被错误排除 无效等位基因对样本分析造成的困扰 无效等位基因 NullAlleles 的解决 降低Tm值扩增更换引物结合区设计兼并引物 额外的染色体引物结合区点突变 特殊峰型 4 突变 三等位基因 4 突变 亲权鉴定观察的突变 PaternalMutation 父亲 母亲 儿子 STR基因座等位基因的正常传递 NoMutation 常染色体STR突变率0 1 0 4 5 微变异 Off Ladder Alleles 核心重复区并非完整的排列插入缺失微变异Allele命名 完整重复数 不完整重复单元的碱基数 Baretal Int J LegalMed 1994 107 159 160 Example TH019 3allele TCAT 4 CAT TCAT 5 确保精确分析 Off Ladder 峰型 尖锐 Ladder准确电泳成功 28 1 1 S25 L25 244 34 244 46 0 12bp 2 SOL L28 257 51 256 64 0 87bpc 1 2 0