专题七：核基质的结构与组成.ppt

2020 2 10 1 专题七 核基质的结构与组成 肖尚英医学生物化学与分子生物学研究所xiaoshy 2020 2 10 2 一 细胞核简介 细胞核是细胞进化的里程碑 它是发现最早 认识最少的细胞器 1674年发现 1831年定名 认识逐步深入 但仍有许多谜团 细胞核是细胞遗传信息 DNA 的贮存 复制和转录的主要场所 真核生物都有一个形态完整 有核膜包裹的细胞核 对细胞的生长 发育 繁殖和遗传 变异起着决定性的作用 细胞核由核被膜 染色质 核仁和核基质组成 图7 1 2020 2 10 3 图7 1 真核生物细胞核结构示意图 2020 2 10 4 在真核细胞核内除染色质 核膜与核仁外 还有一个以非组蛋白为主的网架结构体系 这一网架结构体系最初是由Berezney和Coffey于1974年研究大鼠肝细胞核亚微结构时发现的 并首次将之命名为核基质 nuclearmatrix 2020 2 10 5 核基质是指真核细胞的细胞核依次去除膜脂 可溶性蛋白及染色质后所残留下来的以非组蛋白为主的网架结构 包括核纤层 内部纤维 颗粒状网架结构体系 theinnerfibrogranularnetwork 和核仁基质等三部分 2020 2 10 6 核基质主要成分除非组蛋白外 还含有少量的RNA和DNA 核基质蛋白具有组织 细胞特异性 大量研究表明核基质不仅在维持细胞核的形态结构 而且在染色质 染色体构建 DNA复制 基因表达调控和DNA的损伤修复等细胞生命活动中起重要作用 2020 2 10 7 一 核被膜 核被膜是内膜系统一部分 由核膜 核孔复合体和核纤层组成 其上有许多核膜孔 核膜孔是细胞核与细胞质进行物质交换的选择性通道 核膜由两层膜组成 两膜中间叫核周间隙 核纤层位于核膜内侧 成分为核纤层蛋白 核被膜是控制物质 信息交流的脂双层膜结构 分隔核与质 构成核 质之间的天然选择性屏障 图7 2 核被膜可避免生命活动的彼此干扰 保护DNA不受细胞骨架运动所产生的机械力的损伤 2020 2 10 8 图7 2 核被膜结构示意图 2020 2 10 9 核被膜在细胞有丝分裂中有规律地解体与重建 新核膜来自旧核膜 核被膜的去组装是非随机的 具有区域特异性 domain specific 以非洲爪蟾的卵提取物为基础的非细胞核装配体系提供了实验模型 核被膜的解体与重建的动态变化受细胞周期调控因子的调节 调节作用可能与核纤层蛋白 核孔复合体蛋白的磷酸化与去磷酸化修饰有关 2020 2 10 10 1 核膜 nuclearmembrane 由内外两层单位膜构成 核周间隙 20 40nm 充满液态物质 核外膜的表面附着核糖体 可与RER相连 核内膜的内侧有致密纤维蛋白层 核纤层 的特异蛋白与核纤层相连 稳定核外形 2020 2 10 11 2 核孔复合体 nuclearporecomplex NPC 核孔是由核膜内外层局部融合形成 3000 4000个 细胞 核孔复合体结构模型称为fish trap模型 图7 3 2020 2 10 12 从横向上看 核孔复合体由周边向核孔中心依次可分为环 辐 栓三种结构亚单位 2020 2 10 13 从纵向上看 核孔复合体由核外 胞质面 向核内 核质面 依次可分为胞质环 辐 十栓 核质环三种结构亚单位 形成 三明治 式的结构 2020 2 10 14 核孔复合体主要由蛋白质构成 其总相对分子质量约为1 5 106 推测可能含有100余种不同的多肽 共1000多个蛋白质分子 如 gp210是一种结构性跨膜蛋白 介导核孔复合体与核被膜的连接 将核孔复合体锚定在 孔膜区 从而为核孔复合体装配提供一个起始位点 p62是一种功能性的核孔复合体蛋白 具有两个功能结构域 可能在核孔复合体功能活动中直接参与核质交换 2020 2 10 15 核孔复合体的功能 核质与胞质间物质交换通道具有双向选择性 离子和水溶性小分子通过自由扩散出入 核蛋白运进 具核定位信号NLS RNA和RNP颗粒 核糖体亚基等物质的通过主动运输运出 2020 2 10 16 3 核纤层 Nuclearlamina 内核膜内表面有一层电子密度高的蛋白质网络结构 称为核纤层 厚度为10 20nm 其化学成分为中间纤维 切面观呈片层结构 整体观为球形网络 构成核纤层中间纤维的蛋白有3种 分别称 laminA laminB laminC 分子量在60 75kD之间 图7 4 2020 2 10 17 图7 4 核纤层结构示意图 2020 2 10 18 一般认为核纤层为核膜与染色质提供了结构支架 并介导核膜及染色质之间的相互作用 如 维持核孔的位置和在有丝分裂间期对细胞核膜起支撑作用以维持核被膜的形状 为间期染色质提供锚定位点 为分裂期染色体提供构建附着的位点 介导核膜与染色质之间的相互作用 与在分裂期调控核膜的解离和重新装配有关 2020 2 10 19 在有丝分裂间期细胞核是分区的 每条染色体在核中各自占据一定的区域 有特定的位置 染色体相对分隔的位置是通过染色体上特异位点附着于内层核膜 核纤层 来维持的 核纤层存在于内核模和染色质之间 是核形的决定性因素 与细胞核的各种功能相关 包括DNA复制 RNA转录 细胞核和染色质构建 细胞周期调节 细胞发育和分化 凋亡等 2020 2 10 20 新近的研究还表明 核纤层基因的突变可引起多种遗传病 核纤层蛋白 Lamin 是核被膜内层的纤维蛋白网状结构 构成被膜的骨架 是形成核纤层的关键成分 包括LaminA C LaminB和一些相关蛋白 LaminA C是其两种不同的剪接体 LaminA C可以和pRb相互作用 防止pRb的降解 细胞凋亡时 核纤层蛋白被Caspase 3降解 这是凋亡时细胞核结构改变的基础 有研究发现转录活化因子P300的表达能直接改变细胞核的形态 2020 2 10 21 在转染P300的前列腺癌细胞中 细胞核的形态发生显著改变的同时LaminA C的mRNA和蛋白量显著增加 说明P300通过LaminA C引起细胞核形的改变 核纤层的改变和核型的改变或许会影响染色质的基因位点 进而改变基因表达模式及诱导细胞的恶性转化 2020 2 10 22 二 染色质 处于分裂间期的真核细胞 其染色质是由DNA 组蛋白 其它蛋白和少量的RNA组成的一种线性的复合构造 1974年 R Kornberg 染色质结构的念珠模型 其基本组成单位是核小体 图7 5 染色质是遗传物质在间期细胞的存在形式 常呈网状不规则结构 染色体是在真核细胞分裂过程中由染色质丝盘绕螺旋 折叠 聚缩而成的棒状结构 染色质可被苏木精等碱性染料染色 故称染色质 2020 2 10 23 图7 5 核小体结构模型 2020 2 10 24 1 染色质组成 染色质主要成分是DNA 组蛋白 碱性蛋白 分为H1 H2A H2B H3 H4 其中H1与染色质高级结构形成有关 其余四种参与核小体的构成 维持染色体结构 组蛋白对DNA复制 转录活性有抑制作用 非组蛋白 酸性蛋白 非组蛋白能解除组蛋白对DNA活性的抑止作用 促进DNA复制和转录 RNA 数量少 来源功能不清 2020 2 10 25 2 染色质的存在形式 间期的染色质有利于遗传信息的复制和表达 分裂期的染色体有利于遗传物质的平均分配 染色质和染色体是同一种物质在间期和分裂期的不同存在形式 根据染色后形态的不同 染色质又分常染色质和异染色质 2020 2 10 26 常染色质一般位于核的中央 是间期核中处于伸展状态的DNA分子部分 由于其螺旋化程度低 所以着色较浅 具有转录活性 是经常处于功能活跃状态的染色质 异染色质多分布在核周缘 紧靠核内膜 少数与核仁相结合或散在于核中 是间期核中高度螺旋化的DNA分子部分 由于其螺旋化程度高 所以着色很深 很少转录 功能上处于静止状态 是低活性的染色质 2020 2 10 27 结构异染色质 在各种细胞和细胞发育的任何时期 都为异染色质 常见于染色体的着丝粒 端粒 兼性异染色质 仅在某些类型的细胞中或细胞发育的某个时期为异染色质 如 女性的X染色质 2020 2 10 28 3 染色体的结构 Laemmli提出了染色体 袢环 模型 模型的结构为 图7 6 非组蛋白构成的纤维网架形成染色体支架 螺线管一端与支架结合 另一端向周围呈环状迂回后再回到结合处形成袢环 每个袢环含315个核小体 18个袢环呈放射平面排列形成微带 微带沿染色体纵轴建成染色体 图7 6 染色体结构模型 核基质 2020 2 10 29 三 核仁 necleolus 核仁是细胞核中没有膜包裹的圆形或椭圆形小体 是细胞核中染色最深的部分 是真核生物细胞合成rRNA和装配核糖体的部位 核仁见于间期的细胞核内 呈圆球形 一般1 2个 也有多达3 5个的 核仁的位置不固定 或位于核中央 或靠近内核膜 核仁的数量和大小因细胞种类和功能而异 2020 2 10 30 1 核仁的化学组成与形态结构 核仁由蛋白质 RNA DNA 少量脂类组成 核仁没有界膜包围 呈海绵状网络形态 可分为四部分 纤维成分 纤维丝 RNA和蛋白质 颗粒成分 高电子密度颗粒 是不同成熟度的核糖体亚单位前体 核仁区染色质 包括核仁周边染色质 核仁内染色质两部分 核仁基质 无结构的蛋白质溶液 2020 2 10 31 核仁在电子显微镜下可辨认出有3个特征性的区域 图7 7 纤维中心 fibrillarcenters FC 是被致密纤维包围的一个或几个低电子密度的圆形结构 主要成分为RNA聚合酶和rDNA rRNA基因 这些rDNA是裸露的分子 2020 2 10 32 图7 7 核仁结构示意图 致密纤维组分 densefibrillarcomponent DFC 呈环形或半月形包围FC 由致密的纤维构成 是新合成的RNP 指结合蛋白质的rRNA 转录主要发生在FC与DFC的交界处 颗粒组分 granularcomponent GC 由直径15 20nm的颗粒构成 是不同加工阶段的RNP 是核糖体亚单位成熟和储存的位点 2020 2 10 33 2 核仁相随染色质 nucleolarassociatedchromatin 核仁相随染色质分为两部分 一部分位于核仁周围 称为核仁周染色质 属异染色质 一部分位于核仁内 为常染色质即核仁组织区 NOR 具有组织形成核仁的能力 是rDNA所在的位置 2020 2 10 34 3 rRNA基因转录的形态及组织特征 rRNA基因转录的组织特征 即rRNA的信息来源是位于NORs的rDNA 基因转录的形态特征呈 圣诞树 样结构 rRNA前体需加工和修饰 2020 2 10 35 4 核糖体亚单位的组装 核糖体的生物发生 ribosomebiogenesis 过程包括rRNA的合成 加工和核糖体亚单位的装配 核仁的功能状态 与蛋白质合成有关 一个合成蛋白旺盛的细胞 核仁大而明显 2020 2 10 36 四 核基质 nuclearmatrix 核基质旧称核液或核骨架 nuclearskeleton 由蛋白纤维组成的网状结构 具有支撑细胞核和提供染色质附着点的作用 染色质和核仁都被液态的核基质所包围 狭义概念仅指核基质 即细胞核内除了核被膜 核纤层 染色质与核仁以外的网架结构体系 广义概念应包括核基质 核纤层 或核纤层 核孔复合体结构体系 以及染色体骨架 2020 2 10 37 二 核基质概述 2020 2 10 38 长期以来 对细胞核的研究主要集中于染色质 核仁和核膜 尤其是注重对DNA RNA 组蛋白和核酸酶的研究 核骨架曾长期被人们所忽视 直到70年代中期 Berezney和Coffey等 1974 才首次将核骨架 nuclearmatrix 作为细胞核内独立的结构体系进行研究 用非离子去垢剂 核酸酶与高盐缓冲液对大鼠肝细胞进行处理 当核膜 染色质与核仁被抽提后 发现核内仍存留有一个以纤维蛋白成分为主的网架结构 1991年 Coffey提出核骨架模型 图7 8 2020 2 10 39 图7 8 核基质结构示意图 自Ward Coffey1991 呈网络状的核基质纤维充满核空间 与核纤层和核孔复合体相连 核仁被网络在核基质纤维的网架中 核基质 核纤层和中等纤维形成一个贯穿于核质间的统一网架结构体系 核基质纤维的直径为3 30毫微米 2020 2 10 40 核基质的主要成分是纤维蛋白 其中相当部分是含硫蛋白 并含有少量核糖核酸 RNA 是以蛋白质为主并含有少量RNA的复合物 是否含有少量脱氧核糖核酸 DNA 尚属争论问题 2020 2 10 41 核基质的功能不仅仅依靠核基质本身的蛋白质完成 更重要的是要通过多种核基质结合蛋白的共同参与 完成核基质复杂多样的生物学功能 长期以来人们对此进行了大量的研究并证实一些与DNA RNA代谢合成密切相关的酶类 细胞信号识别和细胞周期的调控因子以及病毒特异的调控蛋白等能够紧密结合在核骨架结构上 2020 2 10 42 核基质具有广泛生物学效应 它可能参与染色体DNA有序包装和构建 对于有丝分裂间期核内DNA有规律的空间构型起着维系和支架作用 可能是DNA复制的基本位点 与基因表达密切有关 可能是细胞核中RNA转录位点和核不均一RNA hnRNA 加工场所 由于核基质与DNA复制 RNA转录和加工 染色体组装及病毒复制等生命活动密切相关 故日益受到重视 2020 2 10 43 一 核基质的形态结构 近年来 核骨架的研究取得很大进展 成为细胞生物学研究的一个新的生长点 由于细胞核内物质密度较大 且有大量染色质纤维 直接在原位研究核骨架的形态结构及成分相当困难 在核骨架研究中 一般首先分离核骨架 然后研究其结构成分及功能 2020 2 10 44 最早是Coffey等用非离子去垢剂 核酸酶与高盐缓冲液 2mol LNaCl 处理细胞核 分离核骨架 Penman等建立的细胞分级抽提方法 先用非离子去垢剂处理细胞 溶解膜结构系统 胞质中可溶性成分随之流失 主要存留细胞骨架体系 再用Tween40和脱氧胆酸钠处理 胞质中的微管 微丝与一些蛋白结构被溶去 胞质中只有中间纤维网能完好存留 然后用核酸酶与0 25mol L硫酸铵处理 染色质中DNA RNA和组蛋白被抽提 最终核内呈现一个精细发达的核骨架网络 结合非树脂包埋 去包埋剂电镜制样方法 可清晰地显示核骨架 核纤层 中间纤维结构体系 图7 9 此后 又有更接近于生理条件的核骨架制备方法出现 如用3 5 二碘水杨酸锂 LIS 处理细胞核来分离核骨架 2020 2 10 45 图7 9 核基质电镜图 核骨架的形态结构根据不同报道有所差异 Berezney与Coffey 1974 等采用高盐溶液2mol LNaCl处理 在核内显示一个以纤维蛋白成分为主的核基质 nuclearmatrix Penman等采用比较温和的细胞分级抽提方法 在核内显示出精细发达的核骨架纤维网络 核骨架纤维直径为3 30nm 估计单丝直径约3 4nm 粗纤维可能是单纤维的复合体 2020 2 10 46 也有报道认为核骨架核心纤维 corefilament 的直径为9nm 核仁与染色质网络位于核骨架纤维网络中 核内骨架与核纤层有丰富的纤维联络 构成统一的核骨架网络 2020 2 10 47 二 核基质的成分 核基质的组成较为复杂 主要组分有三类 非组蛋白性纤维蛋白 分子量40 60KD 占96 以上 其中相当一部分是含硫蛋白 其二硫键具有维持核骨架结构完整性的作用 除纤维蛋白外 还有10多种次要蛋白质 包括肌动蛋白和波形蛋白 后者构成核骨架的外罩 核骨架碎片中还存在三种支架蛋白 scaffoldproteins SC SC SC SC III的功能尚不明确 SC 是DNA拓朴异构酶 2020 2 10 48 少量RNA和DNA RNA对维持核骨架的三维结构是必需的 而DNA称为基质或支架附着区 matrix scaffoldassociatedregion MAR或SAR 通常为富含AT的区域 少量磷脂 1 6 和糖类 0 9 2020 2 10 49 核骨架纤维粗细不等 直径为3 30nm 形成三维网络结构与核纤层 与核孔复合体相接 将染色质和核仁网络在其中 核骨架 核纤层 中间纤维三者相互联系形成一个贯穿于核 质间的统一网络系统 这一系统较微管 微丝具有更高的稳定性 2020 2 10 50 核骨架不象胞质骨架 诸如 微丝 微管和中间纤维那样 由非常专一的蛋白成分组成 不同类型细胞核骨架成分可能有较大差别 目前已测定的核骨架蛋白有数十种 这些蛋白可以分为两类 一类是各种类型的细胞共有的 另一类则与细胞类型及分化程度相关 2020 2 10 51 目前关于核骨架蛋白的确切组分尚未取得共识 这也是核骨架研究中争议较多之处 分离鉴定功能性的核骨架蛋白是目前核骨架研究一个重要领域 比较确定的成分有 1 DNA拓扑异构酶 是间期细胞核骨架和分裂期染色体骨架的重要成分之一 2 核基质蛋白 nuclearmatrin 有matrinD E F G和4等 定位于核基质 且呈现纤维颗粒样分布 很可能是核基质上DNA loop的结合蛋白 2020 2 10 52 3 Nuc2 蛋白 Nuc2 蛋白是S pombe 一种酿酒用的酵母 的Nuc2 基因编码的蛋白 分子量为76kD Nuc2 基因在有丝分裂染色体分离过程中起重要作用 Nuc2 蛋白存在于核基质以及染色体骨架 chromosomescaffold 组分当中 而且与富含AT的DNA序列有特异的亲和性 4 附着区结合蛋白 attachmentregionbindingprotein ARBP 能够特异地与MAR序列结合 而且在各种组织中广泛存在 不具有组织特异性 5 核内肌动蛋白 actin 肌动蛋白不仅存在于核基质组分中 而且很可能在mRNA的合成过程中起重要的作用 2020 2 10 53 有丝分裂器蛋白 nuclearmitoticapparatusprotein NuMA 是形成和维持有丝分裂纺锤体极所必需的成分 属核基质的基础蛋白 分裂末期 NuMA从纺锤体极中释放出并转移至新形成的子核中 在细胞间期 NuMA的作用如何目前知之甚少 正常时 NuMA在核内弥散分布 细胞凋亡时 其分布方式则发生明显的改变 首先变得浓缩 集中在核的中央区 最终围绕在凋亡小体及核碎片的周围 说明NuMA是细胞凋亡的靶蛋白之 2020 2 10 54 肌动蛋白 actin 是首先在细胞质中发现的一种收缩蛋白 近年的研究表明 肌动蛋白也存在于细胞核 是一种核基质蛋白 肌动蛋白有二种存在方式 即G 肌动蛋白 globularactin 和F 肌动蛋白 filamentousactin 肌动蛋白以F 肌动蛋白方式完成其生理功能 在生理状态 肌动蛋白维持细胞核的完整性 参与从染色质重组到剪切的多种功能 p53在修复DNA损伤时 与肌动蛋白的动态结合增加 细胞凋亡时 肌动蛋白重排 其收缩参与细胞核的碎裂和凋亡小体的形成 2020 2 10 55 DNA拓扑异构酶II TopoisomeraseII TopoII 是生物体内广泛存在的一类核蛋白 通过调节核酸结构动态变化 在DNA复制 修复 转录 重组以及染色体分离等生命活动中发挥重要作用 此外 TopoII与肿瘤发生 发展以及治疗和预后等方面有密切联系 作为重要的核基质蛋白和染色体结构蛋白 TopoII能够作用于DNA的核基质结合区 Matrixassociationregions MARs 参与DNA与细胞核基质和染色体骨架的连接 2020 2 10 56 MARs的功能十分重要 它不但是许多基因复制的起点 而且许多转录因子 以及基因表达也与其有密切联系 MARs的另一个特点是 其DNA上富含A T序列 相对于G C序列 A T序列的表现为熔点低 物理性质不稳定 更容易受内在和外在因素影响等特点 研究表明 MARS是DNase超敏感区和易解离点 细胞凋亡早期 TopoIIa蛋白水解 可导致MARs区从细胞核骨架脱落 DNA断裂成50 300kb大分子片段 因此 TopoIIa与细胞凋亡的关系甚为密切 2020 2 10 57 三 核基质结合蛋白 核基质的功能不仅仅依靠核基质本身的蛋白质完成 更重要的是要通过多种核基质结合蛋白的共同参与 完成核基质复杂多样的生物学功能 长期以来人们对此进行了大量的研究并证实一些与DNA RNA代谢合成密切相关的酶类 细胞信号识别和细胞周期的调控因子以及病毒特异的调控蛋白等能够紧密结合在核骨架结构上 近年来已证实的核基质结合蛋白见表7 1 2020 2 10 58 表7 1 核基质结合蛋白 2020 2 10 59 四 核基质的功能 核基质具有细胞核骨架的功能 为DNA的复制提供支架 DNA是以复制环的形式锚定在核骨架上的 核骨架上有DNA复制所需要的酶 如 DNA聚合酶 DNA引物酶 DNA拓朴异构酶II等 2020 2 10 60 DNA的自主复制序列 ARS 也是结合在核骨架上 是基因转录加工的场所 RNA的转录同样需要DNA锚定在核骨架上才能进行 核骨架上有RNA聚合酶的结合位点 使之固定于核骨架上 RNA的合成是在核骨架上进行的 新合成的RNA也结合在核骨架上 并在这里进行加工和修饰 2020 2 10 61 与染色体构建有关 现在一般认为核骨架与染色体骨架为同一类物质 30nm的染色质纤维就是结合在核骨架上 形成放射环状的结构 在分裂期进一步包装成光学显微镜下可见的染色体 图7 10 2020 2 10 62 早在70年代 人们即已能在分子水平上对DNA进行操作 但对如此长的DNA分子在细胞核这样小的空间内如何折叠组装知之甚少 核骨架的研究使人们对细胞核的结构组装有了新的认识 一般认为 核骨架为细胞核内组分提供了一个结构支架 细胞核内许多重要的生命活动与核骨架有关 2020 2 10 63 1 核骨架与DNA复制 Jacob等 1963 就曾设想真核细胞中DNA复制可能需要一个结构支架 structureframework 原核细胞的DNA复制是结合在细胞膜上进行的 在真核细胞中是否存在类似的支撑结构 DNA的复制是否结合在核膜上进行 研究表明真核细胞中DNA复制与核膜没有直接的关系 更无专一的结合位点 70年代中期 染色质结构的研究取得了突破性进展 核小体作为染色体基本结构单位的发现具有十分重要的意义 但并没有回答真核细胞中DNA复制和基因表达的空间支架是什么的问题 2020 2 10 64 核基质可以作为DNA复制的空间支架 拓扑异构酶 使DNA的两条链同时断裂和再连接 当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量 分布在染色质骨架蛋白和核基质部分与复制有关 以往研究体外DNA复制时 大多将细胞中不溶性物质去除 在可溶性上清中研究DNA复制 似乎DNA复制是在可溶性反应系统中完成的 2020 2 10 65 最初的DNA复制模式认为 可溶性的DNA多聚酶结合于DNA复制起始点 origin 后沿模板移动合成新DNA 实际上 高度纯化的DNA在进行体外复制时 效率极低 复制错误多 而在粗提物中 如非洲爪蟾卵提取物无细胞系统 Xenopuseggextractscellfreesystem 中 含骨架组分 DNA复制效率很高 说明DNA的复制的确需要一个结构支架 图7 11 2020 2 10 66 图7 11 染色体构建的支架结构模型 单链结合蛋白 解链酶 DNA 拓扑异构酶 DNA聚合酶 核基质 核骨架 2020 2 10 67 如果DNA多聚酶沿模板移动合成新DNA 则可以设想DNA复制点 replicationsite 是随机分布于细胞核内的 实验表明DNA合成部位在细胞核内不是随机分布的 而是相对集中于某些部位 如精子核中有100 300个复制灶 replicationfoci 每个复制灶中至少有300 1000个复制叉 replicationfork 很难想象非锚定的DNA多聚酶能在时间和空间上如此集中协调一致 说明DNA多聚酶是通过结合于某结构支架上来实现的 2020 2 10 68 Berezney和Coffey以小鼠再生肝细胞为材料 显示新合成的DNA结合在核内蛋白基质网上 3H TdR标记30分钟的3T3细胞中 与核骨架结合的DNA中90 是新合成的DNA 并证明这种结合并非提取过程中产生的非专一性结合 电镜放射自显影进一步表明DNA复制位点结合在核骨架上 2020 2 10 69 研究发现DNA放射环普遍存在于间期细胞核和分裂期染色体中 放射环的根部结合在骨架纤维上 DNA以放射环的形式与DNA复制的酶及因子锚定于核骨架上形成DNA复制复合体 DNAreplicationcomplex 进行DNA复制合成 核骨架可能是DNA复制的空间支架 Berezney和Buchholtz 1981 推测大鼠肝细胞核内有125 000个DNA复制环锚定在核骨架上 每个环的长度为80kb DNA复制子亚单位的复制具有固定的空间组织序列 2020 2 10 70 有令人信服的证据表明 真核细胞中的DNA多聚酶结合于核骨架上 DNA聚合酶在核骨架上可能具有特定的结合位点 DNA聚合酶通过结合于核骨架上而被激活 DNA复制时 DNA就象是从一个固定的复制复合体中释放出来的 2020 2 10 71 2 核骨架与基因表达 核骨架与基因表达的关系大致可分为两类 一 是核骨架与基因转录活性的关系 二 是核骨架与RNA加工修饰的关系 大量研究工作表明真核细胞中RNA的转录和加工均与核骨架有关 2020 2 10 72 Jackson等用3H UdR脉冲标记HeLa细胞 发现95 以上的新合成的RNA结合于核骨架 说明RNA是在核骨架上进行合成的 Volgestin等 1983 利用雌激素促进鸡输卵管细胞卵清蛋白基因转录活性增高这一实验模型 发现只有活跃转录的卵清蛋白基因才能结合于核骨架上 而不转录的 珠蛋白基因不结合 Hentzen等 1984 则显示成红细胞中正在转录的 珠蛋白基因结合于核骨架上 2020 2 10 73 图7 12 DNA复制模型 上述研究表明在鸟类和哺乳动物细胞中 具有转录活性的基因是结合在核骨架上的 图7 12 RNA聚合酶在核骨架上具有结合位点 RNA的合成是在核骨架上进行 基因只有结合在核骨架上才能进行转录 2020 2 10 74 近年来发现在DNA序列中存在核骨架结合序列 matrixassociatedregion MAR MAR一般位于DNA放射环或活性转录基因的两端 富含AT序列 在MAR存在DNA拓扑酶 作用位点 而DNA拓扑酶 就是核骨架的组分 位于放射环根部 DNA可能通过MAR与DNA拓扑酶 的结合锚定于核骨架上 在溶菌酶基因两端接上MAR 可增加基因表达水平10倍以上 说明MAR在基因表达调控中有作用 2020 2 10 75 3 核骨架与病毒复制 病毒是最简单的生命体 其生命活动必须依赖宿主细胞 现已积累的资料表明胞质病毒的代谢与细胞质骨架有关 近年来发现核内病毒的发生与核骨架有密切关系 首先是发现单纯疱疹病毒的核衣壳在核骨架上装配 也有报道显示腺病毒的DNA mRNA及蛋白有结合于核骨架的现象 翟中和等 1987 进一步证实了腺病毒 adenovirus 的复制和装配与核骨架关系密切 作为外源基因的病毒DNA 其基因表达过程与高等真核细胞自身基因表达有相似的规律 其DNA复制 RNA转录及加工均必须依赖核骨架 2020 2 10 76 4 核骨架与染色体构建 在核骨架与DNA复制的关系的研究中 发现DNA以复制环的形式锚定在核骨架上 而细胞核内如此多的DNA复制环与核骨架纤维网如何构建成染色质 核骨架如何参与染色体构建 目前基本上仍是不清楚的 而这是细胞生物学研究中必然要提出的问题 大量研究工作说明DNA复制环是真核细胞DNA高级结构的基本单位 2020 2 10 77 Pienta和Coffey 1984 在此基础上提出DNA复制环与核骨架共同构建染色体的模型 2nm的双螺旋DNA与组蛋白8聚体组装为核小体 其直径为10nm 以6个核小体为单位盘绕为直径为30nm的螺线管 solenoid 形成DNA复制环结合于核骨架上 每18个复制环呈放射平面排列形成微带 miniband 微带是染色体结构的高级单位 大约106个微带沿纵轴构建成子染色体 2020 2 10 78 这一模型将核骨架与染色体骨架基本等同起来 与染色体骨架 放射环模型有许多类似之处 但许多细节是不清楚的 尤其是核骨架与染色体骨架的关系及其在细胞周期中的变化还很不清楚 综上所述 在细胞核这样小小的空间内 容纳如此多的遗传信息 要有序地进行表达 必须在空间上进行有序的调节 2020 2 10 79 在一定时间内 细胞核内只有极少数基因在活跃表达 其它基因处于关闭状态 基因的关闭与开放从实验结果看 与其是否在核骨架锚定有关 从逻辑推理 基因组在核骨架上锚定后可以为DNA解螺旋提供更好的支撑 从而得到更合适的空间 使DNA与聚合酶有更多的接触面 为DNA的转录提供合理的空间与有利的条件 2020 2 10 80 5 核基质与细胞凋亡 细胞凋亡是当细胞受到内外信号刺激时发生的一种由细胞内部基因控制的 主动性的死亡行为 凋亡的细胞具有独特的形态学特征 如染色质凝集 趋边化 凋亡小体的产生等 凋亡细胞的形态学变化 因其具有明显的特征而被广泛认为是细胞发生凋亡的最重要特征 细胞核在凋亡过程的形态学变化过程中扮演了重要的角色 整装电镜技术研究的实验结果表明 在凋亡小体产生 外排过程中与细胞核之间由核基质连接 核基质是凋亡小体的结构基础特异的形态学改变是细胞凋亡的重要特征之一 其中包括染色质凝集 边缘化及凋亡小体的产生等 2020 2 10 81 NeamatiN等人证明lamin的降解发生在形态学变化之前 是形态学变化的基础 非细胞体系作为研究凋亡机理的重要实验手段 细胞核在发生凋亡过程中的一系列形态学变化就显得尤为重要 同时 利用非细胞体系可以更加直观地观察细胞核在凋亡过程中的形态结构变化 避免从凋亡细胞内提纯细胞核过程中所造成的人为假象 2020 2 10 82 自从Penman实验室建立了选择性抽提的方法 核基质结构体系的研究进展得很快 但这一结构体系在凋亡中的变化过程还很不清楚 细胞核的形态变化过程是细胞发生凋亡的一个重要的证据 而这一系列形态学的改变均与细胞核内lamin的降解有关 lamin蛋白的降解是凋亡过程中细胞核发生一系列典型形态学变化的基础 2020 2 10 83 正常细胞中 Lamin与非组蛋白一起在细胞核核内形成核基质的纤维网络结构 支撑核的正常形态并具有重要功能 但核基质的破坏与凋亡的典型形态学特征 凋亡小体的形成之间的关系尚未完全清楚 凋亡的细胞核在电镜下呈现典型的染色质凝集及边缘化 扫描电镜观察的结果显示 凋亡的细胞核表面有凋亡小体样的结构由核内排出 但在此时核基质的变化过程 透射电镜及扫描电镜均不能观察到 2020 2 10 84 五 核基质附着区 MARs 核基质附着区 MARs 是真核生物染色质中与核基质或核骨架特异结合的一段DNA序列 在真核生物的细胞核内 基因组通过MARs与核骨架结合 锚定在核骨架网状结构上 2020 2 10 85 MARs参与DNA复制调控和转录调控等多种细胞核生化过程 同时MARs能使染色质形成独立的环状结构 避免位置效应引起的基因沉默 通过构建合适的表达载体 在目的基因的一侧或两侧连接MARs后导入动植物 目的基因的表达可增强几倍至几十倍 转基因个体间表达水平差异下降 研究认为它对转基因表达有很强的增强作用 或者可以降低不同转基因个体间表达水平的差异 抑制转基因沉默 2020 2 10 86 1 MARs的结构特征 MARs的长度一般为300 1 000bp 也有的达几个kb 维持其活性的最小长度约是300bp MARs是非编码序列 AT含量高 70 不同的MARs序列不同 但往往含有相似的结构基元 典型的MAR一般富含AT 主要由A box T box ATATTT T 序列以及与果蝇拓扑异构酶II位点 GTNA T AC T ATTNATNNA G 相近的同义顺序等特征序列组成 其二级结构表现为狭窄的DNA小沟 易于弯曲和解链 2020 2 10 87 MARs识别序列 弯曲DNA序列 拓扑异构酶 的识别位点等 由于AT之间的氢键力较弱 双链间的配对不稳定 使双链松开在MARs内形成碱基非配对区域 baseunpairingregions BURs MARs序列中含有一些弯曲DNA 每个MARs中所含的弯曲DNA数目及构象不同 即使是同一物种的MARs 其弯曲性也不一样 这也许能解释为什么不同的MARs对核基质的亲和性不同 2020 2 10 88 2 MARs与核基质的结合特征 MARs能与核基质在体外特异结合 这种结合实际上是DNA序列与核基质特异蛋白之间的相互作用 目前已经纯化和鉴定的MARs结合蛋白共10余种 来源于动物的MARs可以和植物核基质结合 反之亦然 不同来源的MARs之间不能交叉杂交 但可与不同来源的核基质不同程度结合 说明其序列同源性虽差 功能在进化上却是保守的 2020 2 10 89 多数MARs富含AT 但这不是特异结合蛋白识别MARs的一个必要前提 MARs与核基质结合的能力由其DNA序列的特定结构如BURs DNA弯曲来决定 因此不同的MARs对同一核基质的亲和性也不同 每个核基质与MARs的结合位点数目在4 105 9 105 并和结合强度呈正相关 A2 box T2 box BURs等MARs识别序列在不同程度上和结合强度相关 新鉴定的基元 90 A2Tbox 与结合强度间的相关性更显著 MARs和核基质的体外亲和性与提高转基因表达的效应之间没有关系 即在体外较高的亲和性并不意味着在体内具有较高的增强转基因表达的效应 2020 2 10 90 已经纯化和鉴定的MARs结合蛋白共10余种 表7 3 包括核基质的重要组分laminB1 matrins topoisomeraseI II HMGI Y highmobilitygroupnonhistone nucleolin 染色质的组分histoneH1 一些富含的特异蛋白 如SATB1 specialAT richbindingprotein ARBP attachmentregionbindingprotein SAF B scaffoldattachmentfactorB SAF A hnRNPU heterogeneousnuclearRNPU nuclearscaffoldproteinSP120 ACBP 67 PAB1 polyAbindingprotein ARSconsensus bindingprotein ACBP 60 PUB1proteinssA TIBF single strandA richtypeIrepeatbindingprotein 参与基因调控的反式作用因子 如NF MuNRandMAR BP1 nuclearfactor munegativeregulator osteocalcingene spromoter bindingfactors NMP 1 2 HIV NMP nuclearmatrixprotein 以及人工合成的MATH multi AThook proteins 2020 2 10 91 表7 2 已经纯化和鉴定的MARs 2020 2 10 92 表7 2 已经纯化和鉴定的MARs 续 2020 2 10 93 从表7 3中所列的MARs结合蛋白的识别序列 我们不难发现 一些组成性的MAR结合蛋白 如laminB1 matrins以及histoneH1 主要识别富含AT的序列 而大部分蛋白则倾向于识别MAR的二级结构 如小沟 弯曲和解链区 富含AT的DNA并不一定就是MAR 一些AT含量较低的DNA序列由于具有MAR的二级结构特征而可以与核基质特异性体外结合 2020 2 10 94 表7 3MAR结合蛋白及其识别位点的主要特征 2020 2 10 95 3 MARs的功能 根据目前已经报道的研究结果 可以将MARs功能概括为以下4个方面 3 1边界因子作用3 2染色质调节作用3 3DNA复制起始子的组分3 4染色体结构组成作用 2020 2 10 96 3 1边界因子作用 边界因子 boundaryelement 界定了独立的基因调节因子的区域 包括基因协作表达所需的所有顺式调节因子 通过抑制染色质构象的传播以阻止调节因子的作用传播到相邻的区域 边界因子使基因与MARs区域之外的调节因子相隔离 而由内源调节因子调控转基因的表达 含有相同转基因拷贝数的独立转化体中 边界因子能降低基因表达的差异性 除此之外 在一个特定的转化体中转基因的表达水平会随着转基因拷贝数的增多而提高 产生拷贝数依赖的转基因表达 2020 2 10 97 MARs将调节因子如启动子和增强子锚定到核基质上 形成一个环形区域 此功能区域具有位置独立效应 能独立进行表达 确保启动子和增强子在染色质中长期的调节作用 2020 2 10 98 3 2染色质调节作用 MARs作为染色质调节因子调节染色质的构象 MARs有助于调节蛋白质的结合和功能的实现 提供一个不连续的浓缩染色质 此外 由于MARs的DNA解链特征 它还作为一个拓扑开关 储存和释放由超螺旋产生的能量 2020 2 10 99 3 3DNA复制起始子的组分 有研究认为 MARs序列是DNA复制起始子的组分之一 或者就是复制起始点 Georgiev等用DNA变性复性实验证明珠蛋白基因的DNA复制子包含有MARs序列 在DNA开始复制形成复制叉后 MARs和核基质结合 使复制叉易于和核基质中结合的复制所需酶及其它蛋白和辅助因子相互作用 细胞内DNA复制所需的酶和复制因子在生理盐水浓度中也不和核基质分开 说明二者在体内可能是以结合状态存在的 而在酵母起始子中 MARs作为一个辅助因子 有助于提高起始子的效率 2020 2 10 100 3 4染色体结构组成作用 在整个细胞周期中MARs始终与核基质结合 它们把染色质分成许多5 200kb大小不等的环 这些DNA环不但是染色质高级组织结构的基本成分 同时也是基因表达的单位 每一个环包括一到多个基因和基因表达所必须的调控序列 在有丝分裂和减数分裂过程中 MARs可以将染色质粘连到有丝分裂期的染色体骨架上 MARs在有着丝粒附着的DNA中很常见 且MARs对有丝分裂期的染色体组装和分裂中期染色体形状的保持起着重要作用 2020 2 10 101 4 MARs对转基因表达的调控作用 虽然MARs有如上的功能特征 但它究竟是怎样增强转基因表达 降低转基因表达水平差异的呢 目前比较流行的解释是由Spiker等提出的染色质环模型 一般情况下 外源基因是随机插入到转化体的基因组中的 如果外源基因插入到活性转录区域 则转基因就可获得正常的表达 若插入到异染色质区域 转基因的表达就会受到抑制 表现为基因沉默 2020 2 10 102 如果在转基因的两侧连接上MARs后 外源基因即使插入到没有转录活性的异染色质区域 通过MARs与核基质的锚定作用 外源基因形成一个独立的染色质环 不受周围异染色质的影响 依然可以得到表达 这个模型中MARs实际上相当于一个隔离子 正是MARs的这些特点和形成的空间结构影响到复制与转录的调节 形成的独立DNA环状结构可减少了环与环间的相互影响 同时通过空间拓扑结构改变和富集调控因子促进环内转录 对环内 环间及环周区域产生影响 它被认为是基因表达调控的顺式调节因子 2020 2 10 103 将MARs连接在表达载体上进行转化 它可引导转基因结合到核骨架上形成独立结构域 减少位置效应 增强转基因表达的拷贝数依赖性 避免插入位点周围染色质的影响 并能克服基因组对外来基因的识别 降低甲基化修饰及剪切 鉴于MARs与基因表达间的关系 尤其它能显著地增强转基因表达 克服位置效应 消除转基因沉默 它已被作为一种顺式调控元件应用到转基因技术中 2020 2 10 104 5 MARs在转基因中的应用 5 1MARs提高转基因表达水平 MARs在已经稳定转化的株系或整个植株中 对转基因表达的增强效应已在大豆 酵母 烟草 西红柿 2菜豆蛋白 鸡溶菌酶 豌豆球蛋白和拟南芥的MARs中有报道 在多数研究中 MARs在单个植株中可使转基因表达水平提高2 9倍 在烟草培养细胞中可提高60倍 而且MARs对转基因表达的增强作用 只有当MARs与植物基因组整合后才能实现 2020 2 10 105 另一方面 人们发现MARs不仅对外源基因的表达有调控作用 而且对位于MARs附近的内源基因的表达也起着举足轻重的作用 Whitelaw等在绵羊临近乳球蛋白基因的3 端鉴定了一个区域 此区域在体外与绵羊和鼠的核基质都能够结合 被鉴定为MARs 研究表明 MARs的去除并不影响 2葡糖醛酸酶 2glucuronidase GUS 基因在mRNA水平上的表达频率 但是 缺少MARs的转基因鼠比野生型中GUS基因的表达低 2020 2 10 106 戴冰冰等将人 2INF基因上游800bp的MARs分别反向和正向克隆至逆转录病毒载体MFC3 LTR上游 以egfp 增强型绿色荧光蛋白 为报告基因观察MARs对egfp基因表达水平以及对病毒滴度的影响 结果显示 反向和正向插入的MARs在瞬时表达的情况下 都不能提高egfp的表达 但在稳定整合的情况下 反向MARs可明显提高egfp在NIH3T3细胞内的表达 而正向插入MARs的MFC作用不明显 说明MARs的作用是有方向性的 2020 2 10 107 Kim等最近发现人 2球蛋白MARs含有的共有序列及拓扑异构酶 的结合位点与MARs对转基因表达的调控密切相关 MAR因子可以将 2半乳糖苷酶 2galactosidase 基因的阳性克隆提高到80 这些克隆的 2半乳糖苷酶表达水平同时也提高了7倍 他们认为这种提高作用是由于MARs使外源基因产生了位置独立效应及拷贝数依赖的表达 同时 他们还发现 2球蛋白MAR因子对 2半乳糖苷酶表达的增强作用与方向无关 2020 2 10 108 Mendu等研究了由MARs和功能基因形成的染色质环大小与转基因表达的关系 他们构建了4种大小不同的质粒载体 GUS Spacer GUS MARs GUS MARs MARs Spacer GUS MARs 结果显示 增大由MARs形成的染色质环并不能降低MARs增强转基因表达的效应 也有研究者认为 环内基因的表达并不随着环的增大而提高 而是与环的大小成反比 小环内的基因往往转录活性更强 2020 2 10 109 5 2MARs降低转基因表达水平差异 在研究MARs对提高转基因表达作用的同时 有些研究者对MARs与降低转基因表达差异的关系做了部分研究 Witold等将含有非配对特征的合成sMAR syntheticMAR 连接到GUS报告基因的两侧 克隆到双元载体pBI121中 然后通过农杆菌介导将含有sMAR和不含有sMAR的载体分别转化烟草