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E玫瑰花环形成实验 中山医学院免疫教研室2012 04 ERosetteFormingCellTest 掌握E花环形成的原理熟悉E花环形成实验的步骤及光镜下E花环的形态熟悉磁珠分离的原理 实验目的 T细胞的表面分子是T细胞与其它细胞和分子间相互识别及作用的物质基础 它们在T细胞活化 增殖和分化等过程中起重要作用 TCR CD3复合物参与T细胞的抗原识别和信号转导 CD2 CD28 CTLA 4 CD45 CD40L等膜蛋白参与T细胞活化及T细胞与其它细胞间相互作用 CD4 CD8分子辅助TCR识别结合抗原 参与信号转导 根据CD4和CD8分子的表达将其分为CD4 T和CD8 T细胞 T细胞表面分子 依靠表面标记的分离方法 流式细胞术分离法 利用各种荧光素标记的表面标记特异性抗体 使不同表面标记的细胞结合上不同的荧光素 借助荧光活化细胞分选仪将各种细胞分离开来 免疫磁珠分离法 将针对细胞某种表面标记的特异性抗体包被在磁性微珠上 与磁珠交联的抗体能够特异性结合具有这种表面标记的细胞 然后用强磁场可将具有这种表面标记的细胞分离出来 磁珠 microbead 标记细胞上的磁珠在扫描电镜下也几乎看不到 磁珠分离策略 一 阳性分选 磁珠标记目的细胞 未标记细胞先行流出 移出磁场后收集目的细胞 CD4 T细胞 分离柱 CD4 T细胞 磁珠标记非目的细胞 目的细胞先行流出 二 阴性分选 成熟的人T细胞表面表达绵羊红细胞 SRBC 受体 即CD2分子 能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构 可在光学显微镜下观察计数 本法可用于分离外周血T细胞及检测T细胞的数量和比例 E花环分离法原理 实验材料 1 肝素抗凝血2 Hank s液3 淋巴细胞分离液4 绵羊红细胞悬液5 灭活小牛血清6 水平离心机 37 温箱 显微镜等 实验方案 取外周血 绵羊红细胞 淋巴细胞 分离 显微镜下观察 实验步骤 用Hank s液配成106细胞 0 1ml 加等量灭活小牛血清 0 1ml 取0 1ml 加入0 5 绵羊红细胞0 2ml 混匀 37 温箱放置5分钟 1000rpm离心5min 加1小滴1 美蓝 用毛细吸管轻轻混匀 取1滴于玻片上 加上盖玻片 高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞 置4 冰箱 5min 30 45min 结果判断 凡能结合三个以上绵羊红细胞者为玫瑰花形成阳性细胞 正常人的花环形成率50 70 大致可以代表周围血中T细胞的百分数 左 甲紫染色 800 可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞 右 吖啶橙染色 图中可见3个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围 T淋巴细胞玫瑰花环 T淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜 6500 测定外周血中的T细胞数 观察受检者的细胞免疫功能及免疫增强剂的疗效 观察免疫抑制剂的效果 协助进行恶性肿瘤疗效的观察及预后判断等 临床应用 注意事项 1
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