大豆蛋白的提取与含量测定.ppt

大豆蛋白的提取与含量测定 指导老师赵建军曲宁夏婷孟繁新 蛋白质性质与应用技术关系图 肽氨基酸 疏水性亲水性 纸层析 一 大豆蛋白的提取 目的要求1 掌握大豆蛋白的提取原理和方法2 计算粗提产率2 学习计算蛋白质收率实验原理大豆中含有丰富的蛋白质 根据提取方法及其其性质的不同 可以分为水溶蛋白 盐溶蛋白 醇溶蛋白 碱溶蛋白 将豆粉依次用上述溶剂提取 并用有机溶剂沉淀 可制得各部分蛋白质的干粉 本实验主要是水溶提取大豆蛋白 称出提出蛋白质的重量 已知原料重量 可以求出蛋白质的收率 试剂和器材 1 试剂 1 10 Nacl 2 0 2 NaoH 3 75 乙醇 4 6mol LHCL 5 1mol LHCL 6 1mol LNaoH2 器材 1 离心机 2 烧杯 3 滴管 4 PH试纸等 操作方法 1 水抽提将豆粉5g用约50毫升左右的蒸馏水少量多次的添加搅拌 常温下搅拌抽提15min 3800r min离心15min 取上清液 如上清液不清澈再经过滤 取上清液1毫升稀释100倍留做蛋白测定 其余上清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮 用滴管少量多次慢慢滴加 搅拌 用6mol L和1mol LHCL 调PH4 5 5 0 3800r min 离心15min 收集沉淀物 反复用丙酮搅拌洗涤离心2次 放入表面皿上 60度烘干 得到粉末状蛋白质干粉 称重 计算粗产率 蛋白质产物重量蛋白质产率 100 原料总重量Folin酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分 二 Folin酚法测定蛋白质含量 目的要求掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法实验原理蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质 如比重 紫外吸收 折射率等测定而得知 或用化学方法 如定氮 双缩脲反应 Folin酚试剂反应等方法来计算 其中双缩脲法和Folin酚法是一般实验室中常用的方法 它们操作简便 迅速 不需要复杂而昂贵的仪器 Folin酚法灵敏度高 比双缩脲法灵敏100倍 Folin酚法所用试剂是由两部分组成 试剂甲相当于双缩脲试剂 可与蛋白质中的肽链起显色反应 试剂乙中的磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下不稳定 易被酚类还原而呈兰色 钼兰和钨兰混合物 由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸还原呈兰色 溶液兰色的深浅与蛋白浓度成正比 因此用Folin酚法测定蛋白质含量 灵敏度较高 样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用 如果样品酸度较高则显色较浅 要提高碳酸钠一氢氧化钠的浓度 此法也可测定溶液中酪氨酸和色氨酸的浓度 Folin酚法有不少个别改进的操作方法 但基本原理都是一个 只是在各溶液的浓度及填加量上 保温的温度及保温时间上有所不同而已 本实验所介绍的是本室常用的 灵敏度较高的操作方法 试剂和器材 1 材料 本实验所提取大豆蛋白水提取液 经合适稀释至可测定范围 2 试剂 1 0 03mol LPH7 8的磷酸缓冲液 2 200 g ml的标准酪 牛血清 蛋白溶液 3 Folin试剂甲 俗称碱性铜试剂 10gNaoH溶于400ml水中 再加50gNa2CO3 称取0 5g酒石酸钾钠溶于80mlH2O中 再加0 25gCuSO4 以上两溶液混合定容到500ml 冰箱保存可用一个月 4 Folin试剂乙 在2升磨口回流装置的烧瓶内 加钨酸钠 NaWO4 2H2O 100g 钼酸钠 NaMoO 2M2O 25g 蒸馏水700ml 85 的磷酸50ml 浓盐酸100ml 充分混合后 小火回流10小时 再加硫酸锂 Li2SO4 150g 蒸馏水50ml及数滴溴 然后开口沸腾15min 以驱除过量的溴 冷却后定容到1000ml 过滤后呈金黄色 于棕色瓶中保存 可使用多年 上述制备的Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol L左右 几种操作方案都是把Folin试剂乙稀释至1mol L的浓度作为应用液 我们是把贮备液于作用前稀释18倍 使之浓度为0 1mol L略高 这种稀释18倍后的Folin试剂乙就是下文称之为应用液 Folin试剂乙贮备液浓度的标定 一般是以酚酞为指示剂 用Folin试剂乙去滴定1mol L左右的标准NaOH溶液 当溶液颜色由红变为紫灰色 再突然变成黑绿既为终点 如果用NaOH去滴定Folin乙 终点不太好掌握 溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色 再变为灰紫色为终点 3 器材 试管10支试管架一个移液管 5ml 1ml 移液管架洗瓶恒温水浴723型分光光度计 Folin 酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作 取6支试管 干燥的 按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定K 0 308B 0 009R R 0 9909 2 样品测定 取三支试管 平行 各加入待测的蛋白质样品液1ml和空白 如下操作 3 蛋白质浓度的计算 A