topo克隆和点突变.ppt

TOPO克隆技术与基因定点突变技术 北京全式金生物技术有限公司 背景资料 基因克隆是分子生物学必不可少的工具 传统的T4DNALigase方法实验周期长 TOPO克隆 5分钟快速克隆 是克隆技术的革命 这个技术上的飞跃为实现 加速科研 的理念提供了先决条件 基因定点突变技术 改造基因的便利方法 基因功能研究已经成为生命科学研究的新热点 因此需要强有力的工具保证基因结构和功能关系研究的进行 TOPO克隆技术 TOPO克隆原理TOPO克隆策略TOPO克隆成功的关键TOPO克隆常见问题及解决方法 TOPO克隆原理 TOPO即Topoisomerase拓扑异构酶特点 由316个氨基酸组成识别5 CCCTT 3 同时具有限制性内切酶和连接酶的功能不需要能量 TOPO克隆 原理 TOPO克隆 过程 TOPO克隆 过程 TOPO克隆迅速 便捷 TOPO克隆 克隆策略 有无杂带 有无引物二聚体 基因克隆 转化 TOPO克隆和传统T4克隆比较 TransGenTOPOVector pEASY T1CloningVetorpEASY T1SimpleCloningVetorpEASY T3CloningVetorpEASY BluntCloningVetorpEASY BluntSimpleCloningVetorpEASY E1ExpressionVetorpEASY E2ExpressionVetor 克隆载体图谱 TACloning 克隆载体图谱 BluntCloning 表达载体 TACloning 一步法载体构建 藉由TOPO技术实现 TOPO克隆成功的关键 引物设计PCR条件克隆反应设置 DNA加入量 反应的温度和时间 克隆感受态细胞的选择选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒 引物设计 引物不能磷酸化 引物5 端第一个碱基会影响下游的连接效率 PCR注意事项 后延伸设置为72 10 20分钟 目的 保证扩增片段完整 可以有效降低扩增背景 使用Taq系列DNA聚合酶扩增时 该步骤相当于加A反应 目的片段加入量 为保证良好的连接效率 推荐如下 700bp以及更小的片段 保证20ng 700bp以上的片段 保证30 100ng 2Kbp左右的片段 保证40ng 3Kbp左右的片段 保证60ng 片段加入量max 4 l 浓度很低时也有一定的连接效率 体积大于5 l会破坏反应体系平衡 片段加入量min 0 5 l 浓度很高时需要稀释 可以补充无菌水方便操作 反应温度 TOPO酶的工作温度为20 37 反应时间 克隆感受态细胞的选择 选择质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒 试剂品质很关键质量不好的试剂盒很可能会抑制下游连接 TOPO克隆常见问题及解决方法 克隆数少 确认感受态细胞效率正常时 克隆阳性率低PCR鉴定重组子失败菌落多为淡蓝色或FishEye 白边蓝芯 克隆数少或阳性率低 上述五种情况 均需要适当延长连接反应时间 以保证连接效率和克隆数 可参考上文的载体连接反应时间 另外每种情况也有一些特别的地方可以改进 进一步提高克隆效果 PCR产物不新鲜 Why 3 端热力学不稳定 3 A 容易脱落直接导致TA克隆效率低How PCR产物置于4 保存1 2天内使用不要冷冻PCR产物PCR结束后立即使用效果最好 克隆胶回收片段 Why 紫外照射和EB对dsDNA造成损伤 受到损伤的DNA不是连接的最佳底物 3 A 容易在电泳过程中被核酸外切酶降解 导致TA连接效率低 试剂残留的抑制 How 操作中通过细节注意避免 目的片段浓度很低 Why 无法保证有效碰撞How 浓缩DNA 毒基因 Why 其本底表达产物对宿主生长有明显抑制How 选用Top10 基因特殊结构 Why 具有高AT 高GC 反向重复序列的基因 不容易连接How 调整 摸索连接体系和条件尝试不同的载体 不同的骨架对片段偏好性不同 PCR鉴定重组子失败 现象 用通用引物鉴定时 扩增产物既无目的带又无载体自连带How 预变性95 10min 彻底裂解菌体 释放DNA 最好能用通用引物鉴定 菌落多为淡蓝色或FishEye Why 插入片段没有影响LacZ基因读码框插入片段小 小于400bp How 不要丢弃平板 进行进一步鉴定 基因定点突变技术 利用PCR实现点突变的几种传统方法GeneTailor QuickChange Easy FastMutagenesisSystem三种市售点突变试剂盒的比较 传统方法 仅利用PCR 反向PCR定点突变重叠延伸PCR定点突变大引物PCR定点突变 反向PCR 特点 必须以质粒为模板 引物方向相反 引物需要磷酸化 重叠延伸PCR 特点 两轮PCR 大引物PCR 特点 两轮PCR GeneTailor QuickChange Easy FastMutagenesisSystem也是基于PCR原理实现点突变 但它们与传统方法的区别主要在于可以对突变克隆进行初步的筛选筛选原理 降解甲基化质粒模板筛选依据 来自大肠杆菌的质粒99 发生甲基化 PCR是去甲基化过程 PCR产物 发生突变的产物 是去甲基化的产物 筛选方法 体内降解 原始质粒模板可以被能降解甲基化质粒的大肠杆菌 DMT 降解 而去甲基化的扩增产物 发生突变的产物 不会被降解 体外降解 DpnI识别序列5 GmATC 3 在DNA序列中 一般每256bp中出现一次 甲基化模板可被DpnI识别 切割 而去甲基化的扩增产物 发生突变的产物 不会被降解 Invitrogen GeneTailorMutagenesisSystem 优点 引物部分重叠 指数扩增 扩增产物可见 易于操作 筛选方法 DMT体内降解缺点 突变点在一条引物上 无DpnI限制性内切酶降解模板 Stratagene QuickChangeMutagenesisSystem 优点 筛选方法 DpnI限制性内切酶缺点 引物完全重叠 线性扩增 扩增产物不可见 可操作性差 扩增产物为线状 无DMT体内消化降解模板 TransGen Easy FastMutagenesisSystem 共有部分 PCR组分 DpnI酶 DMT细胞EasyMutagenesisSystem 使用EasyPfu酶FastMutagenesisSystem 使用FastPfu酶 扩增速度比Taq更快 保真性比Pfu更高 扩增10Kb左右的质粒只需2个小时 请参考 金品是怎样炼成的 TransGen 引物部分重叠 指数扩