苦荞全生育期芦丁积累与其生物合成途径相关基因表达分析VIP

中国农业科学 2017 50 18 3473 3481 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2017 18 004 收稿日期 2017 03 07 接受日期 2017 05 03 基金项目 国家自然科学基金 31301385 山西省科技攻关项目 20150311007 1 山西省回国留学人员科研项目 2017 069 山西省主要农作物 种质创新与分子育种重点科技创新平台 2016 246 联系方式 孙朝霞 E mail通信作者杨武德 E mail sxauywd 苦荞全生育期芦丁积累与其生物合成途径相关基因表达分析 孙朝霞 侯思宇 令狐斌 刘荣华 王丽 杨武德 韩渊怀 山西农业大学农学院 山西太谷 030801 摘要 目的 探究苦荞全生育期芦丁含量变化与其合成途径关键酶基因和调控因子 MYB 基因表达量之间的 相关性 以期进一步明确苦荞植株体内芦丁生物合成的分子机制 方法 以九江苦荞为试验材料 整个生育期分 别在萌发期 子叶期 真叶期 盛叶期 现蕾期 盛花期 灌浆期和籽粒成熟期共 8 个时期取材 S1 S8 采用 RT PCR 方法 克隆获得与黄酮类代谢相关的 MYB 类转录因子基因 采用 T coffee 软件进行氨基酸同源序列比对 及保守结构域分析 与拟南芥黄酮类代谢相关的 MYB 转录因子及荞麦同源 MYB 转录因子序列比对 基于邻近法构 建系统进化树 实时荧光定量 PCR 技术分析芦丁合成途径中 5 个关键酶FtCHS FtF3H Ft4CL FtFLS like和FtUFGT 及上述克隆到的 MYB 转录因子在不同组织中的表达模式 基于高效液相色谱法 HPLC 测定全生育期取材组织的 芦丁含量 同时采用相关性分析方法分析不同组织中芦丁含量变化与基因表达模式的相关性 转换上述数据为矩 阵 采用欧式距离法构建共表达层次聚类图谱 结果 克隆到 2 个 MYB 类转录因子 即FtMYB7和FtMYB9 其核 酸序列长度分别为 876 和 912 bp 分别编码 291 和 303 个氨基酸残基 氨基酸序列同源性比对分析结果表明 二 者均具有典型的 R2R3 保守结构域 为 R2R3 类型的 MYB 转录因子 结合 Nr 数据库中 17 个苦荞和 3 个拟南芥黄酮 类代谢相关 MYB 转录因子同源氨基酸序列构建系统进化树 结果表明这 22 个基因分成 6 大类群 其中FtMYB7属 于第 II 类群 FtMYB9属于第 IV 类群 二者分属于不同类群 暗示这 2 个 MYB 转录因子可能涉及调控植物生长发 育过程中不同功能类型 荧光定量结果显示 FtMYB7在 S3 真叶期 和 S5 现蕾期 基因相对表达量最高 达 到 501 和 867 倍 FtMYB9在 S1 萌发期 和 S2 子叶期 相对表达量最高 分别为 34 和 72 倍 上述基因表达 量与芦丁含量变化模式相关性分析表明 8 个生长时期中 Ft4CL FtCHS FtF3H FtUFGT和FtMYB7相对表达模 式与芦丁含量变化幅度呈正相关 其相关系数分别为 0 748 0 683 0 704 0 890 和 0 862 而FtFLS like和 FtMYB9与芦丁含量的变化幅度呈负相关 其相关系数分别为 0 442 和 0 501 结论 FtMYB7 和 FtMYB9 转录因 子在整个生育时期中表达模式存在明显差异 其中FtMYB7可能在苦荞芦丁积累的过程中起到正调控作用 而 FtMYB9则为负调控作用 关键词 苦荞 芦丁 MYB 基因 基因表达 Correlation Analysis on Rutin Accumulation and Gene Expression of Rutin Synthetic Enzymes and MYBs in the Whole Developmental Stage of Fagopyrum tataricum SUN ZhaoXia HOU SiYu LINGHU Bin LIU RongHua WANG Li YANG WuDe HAN YuanHuai College of Agronomy Shanxi Agricultural University Taigu 030801 Shanxi Abstract Objective To explore the relationship among the rutin content at different developmental stages with rutin biosynthesis genes and MYB regulation genes it will be very meaningful to understand the underlying molecular metabolism of rutin accumulation in tartary buckwheat Method The whole developmental stages of F tatarium Jiujiang were classified into 8 stages 3474 中 国 农 业 科 学 50 卷 germination first pair of leaf formation true leaf growth vegetative growth flowering peak flowering immature seeds matured seeds which were named S1 S8 stages The whole seedlings from S1and S2 stage leaves from S3 and S4 stage flowers from S5 and S6 stage seed formation organ from S7 and S8 stage were used as test materials Two MYB genes FtMYB7 and FtMYB9 were cloned and sequenced The homologous amino acid sequence and conservative structure domain analysis were carried out by T coffee software The phylogenetic tree was constructed by the NJ method neighbor joining The multiple sequence alignment of MYB transcription factors related with flavonoids among Arabidopsis and buckwheat were analyzed by MEGA 7 0 software The rutin content of these tissues at S1 S8 stages was detected by HPLC In the meantime the expression level of rutin biosynthesis related genes FtCHS FtF3H Ft4CL FtFLS like and FtUFGT and regulator genes FtMYB7 and FtMYB9 were investigated by qRT PCR The correlation of rutin content and the gene expression pattern during the whole developmental stage was estimated by Pearson correlation method These data were transformed to matrix data and constructed a Hierarchical cluster heat map by Euclidean distance method Result Cloned two MYB transcriptional factors FtMYB7 and FtMYB9 their nucleic acid sequences were 876 and 912 bp respectively encoding 291 and 303 amino acid residues The sequences of 17 MYB transcription factor from buckwheat and 3 genes related to flavonoids metabolism in Arabidopsis were constructed for a phylogenetic tree The phylogenetic tree showed that these genes were divided into six groups Among them FtMYB7 belongs to the group II and FtMYB9 belongs to IV groups the result indicated that the two MYB transcription factors involved in function diversity at regulation of plant growth and development process The qRT PCR results showed that the relative expression levels of FtMYB7 at S3 and S5 stages were the highest at 501 and 867 times respectively To FtMYB9 the highest gene expression levels were detected at S1 and S2 stages and 34 and 72 times respectively Correlation analysis showed that during 8 growth stages Ft4CL FtCHS FtF3H FtUFGT and FtMYB7 expression patterns were positively correlated with rutin content and the correlation coefficient was 0 748 0 683 0 704 0 890 and 0 862 respectively However FtFLS like and FtMYB9 were negatively correlated with rutin content and the correlation coefficients were 0 442 and 0 501 respectively Conclusion The FtMYB7 and FtMYB9 were characterized by two R2R3 MYB genes The different gene expression patterns and rutin content at the whole developmental stage of tartary buckwheat suggested that the FtMYB7 is positively regulated in rutin biosynthesis but the FtMYB9 is negatively regulated Key words Fagopyrum tataricum rutin MYB genes gene expression 0 引言 研究意义 苦荞又称鞑靼荞麦 Fagopyrum tataricum 系蓼科荞麦属一年生的双子叶杂粮作物 苦荞是典型的药食同源作物 其籽粒含有的特殊的黄 酮类化合物 芦丁 rutin 具有较高的抗氧化活 性 有抗癌作用 且可有效降低高血压和高血脂的风 险 1 2 苦荞籽粒中芦丁含量高达 2 其叶 花和茎 也均有较高含量芦丁存在 3 当前 从植物中提取有 效的天然药用化合物来代替化学合成的药用化合物或 直接供人们食用 从而降低化学合成药物对人体的副 作用 已在一些专家学者中达到共识 因此 培育高 芦丁含量苦荞品种 系 作为天然药用化合物提取的 资源库或直接提供给特殊人群食用作为专性功能食 品 已成为苦荞育种的一个重要方向 MYB 类转录因 子在调控植物次生代谢中起到重要的作用 其家族成 员庞大 如拟南芥中有 196 个 白菜中有 256 个 每个成员担负着调控不同生物代谢过程的功能 4 5 目 前 调控苦荞黄酮醇类化合物的 MYB 转录因子研究 报道较少 因此分离鉴定调控苦荞芦丁生物合成的 MYB 转录因子 对进一步阐明苦荞植株中芦丁生物合 成的分子机制具有重要意义 6 前人研究进展 拟南 芥中共有 125 个具有 R2R3 结构域的 MYB 转录因子 已证实这些转录因子参与多种生物功能 聚类分析表明 这些转录因子被分为 25 类 S1 S25 其中 AtMYB11 AtMYB12 和 AtMYB111 归为 S7 类 分别调控不同组织 内黄酮类化合物的生物合成 因此 这类基因也称为 PFG1 3 production of flavonol glycosides 7 9 在柑橘 全基因组分析中 获得 101 个 R2R3 MYB 转录因子 已被证实参与生长发育调节 非生物胁迫及植物激素 响应的过程 10 CZEMMEL 等 11 也证实 VvMYBF1 直接调控葡萄果实黄酮醇的合成 芦丁生物合成途径 已经研究较为清楚 参考 KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 代谢途径数据库中关于黄酮 和黄酮醇类生物合成途径图谱 芦丁生物合成途径 中的关键酶包括苯丙氨酸解氨酶 phenylalanine ammonialyase PAL 肉桂酸 4 羟化酶 cinnamate 4 hydroxylase C4H 4 香豆酸辅酶 A 连接酶 4 coumarate coenzyme A ligase 4CL 查耳酮合成酶 chalcone synthase CHS 查耳酮异构酶 chalcone 18 期 孙朝霞等 苦荞全生育期芦丁积累与其生物合成途径相关基因表达分析 3475 isomerase CHI 黄酮醇 3 脱氢酶 flavonol 3 dehydrogenase F3H 黄酮醇合成酶 flavonol synthetase FLS 和黄酮糖基转移酶 UDP glucoronosyl UDP glucosyl transferase UFGT 先前从苦荞叶片和花 cDNA 中克隆到芦丁合成途径中 5 个关键酶基因 Ft4CL FtCHS FtF3H FtFLS like 和 FtUFGT 12 植 物中 CHS EC 2 3 1 74 是黄酮类生物合成的第一个 关键酶 也是整个合成过程中的第一步限速酶 直接 影响下游次生代谢产物的产量 13 14 而 4CL EC 6 2 1 12 是植物苯丙烷类代谢途径转向黄酮类物质代 谢的关键酶之一 也是该途径的限速酶 15 F3H EC1 14 11 9 是黄酮类合成途径分支点的一个核心 酶 可将柚皮素转化为二氢黄酮醇 而二氢黄酮醇是 黄酮和异黄酮化合物合成的重要底物 因此该酶是类 黄酮合成途径上的一个关键中枢 直接影响下游类黄 酮产物的合成 16 FLS EC1 14 11 23 是黄酮醇类化 合物合成途径中最重要的下游关键酶基因 同时也是 花青素和芦丁合成的一个分支 12 17 UFGT EC 2 4 1 115 是芦丁合成途径中的最后一步关键酶 其功能为糖基化槲皮素 从而最终转化为芦丁化合 物 18 荞麦中黄酮醇合成途径关键酶基因的表达模式 已有相关研究报道 赵海霞等 19 报道了种子不同萌发 时间下 苦荞芽期总黄酮含量与 2 个 MYB 转录因子 的相对表达量呈显著相关 同时黄酮醇合成途径中 3 个关键酶 CHI PAL 和 FLS 相对表达量也呈显著正相 关 GUPTA 等 20 报道了苦荞不同生育阶段 PAL CHS CHI 和 FLS 表达量与芦丁含量也呈现正相关 以上研究一定程度上揭示了苦荞植株体内芦丁含量的 积聚与芦丁生物途径关键酶基因的表达具有正相关 性 同时受到 MYB 转录因子的调控 但针对整个生 长周期中苦荞植株中芦丁合成的变化趋势与相关基因 的表达是否相关 目前仍需进一步探索研究 最新的 研究表明 8 个苦荞 MYB 转录因子受到 ABA NaCl PEG 等不同非生物胁迫的诱导表达 可能在苦荞次生 代谢物合成中起到重要的调控作用 21 本研究切入 点 前人已报道的苦荞 MYB 转录因子大多与非生物 胁迫和花青素代谢调控相关 而与苦荞不同组织中关 键黄酮类物质 芦丁代谢调控相关的 MYB 转录因子研 究报道较少 拟解决的关键问题 通过研究苦荞全 生育期不同组织中芦丁含量变化趋势是否与其生物合 成途径中5个关键酶基因和2个MYB转录因子表达水 平相关性 以期明确 2 个 MYB 基因调控芦丁生物合成 途径关键酶基因组织特异表达特征 1 材料与方法 1 1 供试植物材料 自繁的高代纯系九江苦荞种子 2015 年 6 月种植 于山西农业大学农学院实验站 按苦荞生长时期进行 取材 命名为 S1 S8 具体取材时期即部位如下 S1 为萌发期 即种子播种后 6 d 萌发的幼苗整株取材 S2 为子叶期 即播种 10 d 后 子叶完全展开 整株 取材 S3 为真叶期 即播种 15 d 后 第一片真叶展 开 取第一片真叶 S4 为盛叶期 即播种 35 d 后 叶片大量生长 取顶端完全展开叶 S5 为现蕾期 即 生长 45 d 后 取第一批出现的幼嫩花蕾 S6 为盛花 期 即生长 55 d 后 大量花朵出现 受精的花蕾出现 籽粒形态 取受精后花蕾 S7 为灌浆期 即生长 65 d 后 大量的籽粒形成 取幼嫩籽粒 S8 为成熟期 籽 粒颜色由绿转灰黑 生产上为可采收阶段 取健康饱 满籽粒 1 2 总 RNA 提取及基因克隆 取 0 1 g 上述苦荞不同生育期不同组织放入预冷 的研钵中 液氮研磨成粉末状 使用植物 RNA 试剂 盒提取各组织中 RNA 天恩泽基因有限公司 北京 DNase I 宝生物大连有限公司 消化处理 1 g 总 RNA 微量高精度紫外分光光度计 NanoDrop 2000 美国 检测总 RNA 浓度及纯度 1 5 琼脂糖凝胶电 泳检测总 RNA 完整度 cDNA 第一链合成采用总反应 体系 10 L 其中 1 g 总 RNA 1 L g 1 5 L 2 PrimeScript RT Master Mix 包含10 mmol L 1 dNTP mixture 50 mol L 1 Oligo dT primer 和 200 U PrimeScript RTase 4 L RNase free 超纯水补足体 系 试剂购于宝生物 大连 有限公司 反转录 PCR 程序为 37 15 min 85 5 s 根据苦荞转录组测序 数据 未发表 设计 FtMYB7 和 FtMYB9 完整 CDS 区克隆引物 引物名称及序列见表 1 采用 RT PCR 方法从苦荞叶片 cDNA 文库中克隆其序列 RT PCR 反应程序为 95 5 min 95 30 s 55 45 s 72 90 s 30 个循环 72 5 min 样品测序由华大基因 北京 完成 1 3 基因的结构域及系统进化分析 采用 T Coffee Multiple Sequence Alignment Server http tcoffee vital it ch apps tcoffee index html 在线 分析工具 22 分析 FtMYB7 GenBank 登录号 KM588379 FtMYB9 KM588380 AtMYB11 NP191820 AtMYB111 NP199744 和 AtMYB12 3476 中 国 农 业 科 学 50 卷 NP182268 的保守结构域 下载 NCBI 数据库 https www ncbi nlm nih gov 中已公布的 17 个苦荞 MYB 转录因子序列和本试验提交的 2 个序列 以及 AtMYB11 AtMYB111 和 AtMYB12 为外类群 共 22 个氨基酸序列 利用 MEGA 6 0 软件 采用邻近法 neighbor joining NJ 构建系统进化树 1 4 基因表达分析 设计 Ft4CL GenBank 登录号 KM362863 FtCHS KJ139980 FtF3H HM587134 FtFLS like GU388434 FtUFGT 未提交 FtMYB7 和 FtMYB9 引物 表 1 以九江苦荞的根 茎 叶 花 幼 胚 cDNA 第一链为模板进行 qRT PCR 分析 每个样 品设置 3 个生物重复 3 个技术重复 荧光定量 PCR 总反应体系 10 L 包含 5 L 2 SYBR Premix Ex Taq II 1 L 50 ng L 1 cDNA 模板 上下游引物各 0 5 L和3 L RNase free H2O 扩增程序为95 30 s 95 5 s 58 30 s 40 个循环 以内参基因 FtHis JF769134 的 Ct 值作为对照 采用 2 Ct法计算 基因相对表达量 12 所用荧光定量试剂购置于宝生 物 大连 有限公司 表 1 试验所用引物序列 Table 1 The primer sequences 引物名称 Primer name 序列 Sequence 5 3 FtMYB7 F ATGGGAAGACCTCCTTGCTGT R GCGGCGGTACTAGACAAGATT FtMYB9 F ATGGGAAGGGCTCCTTGTT R TCAGATGACAAAGACTCAG FtCHS Q F GCCGACTACCCCGACTACTAC R TGAGGATCTCCTCGGTTAGGT FtF3H Q F TAGAGGCACCAATCACCTTTG R CTTTGCCTTGTCGAGATTCTG Ft4CL Q F GTGAGGTTCCTGTGGCATTT R TTGCGTGAACGAAGTACACC FtFLS Q F CAAGACTCCGAAGTGGAAGC R TCCCGTTGCTCATAATCTCC FtUFGT Q F GGTTTTCAACCACGCATATG R GCCTCTAACTAAGCAGCACAA FtMYB7 Q F TGTCACAGCAAGGAGGTCTTC R TTGCTAGGCTGTCCAAAGTGA FtMYB9 Q F TTGCTGAGTCTTTGCTCATCTG R AGGAAACCATCCAAATCAAAGC FtHis Q F ATTCCAGAGGCTTGTTCGTG R CATAATGGTGACACGCTTGG 1 5 芦丁含量测定 高效液相色谱法检测苦荞不同生长时期试验材料 的芦丁含量 具体测定方法参考郭彬等 3 方法 所有 测定样品均设置 3 次生物学重复 1 6 相关性及热图聚类分析 统计上述基因表达值和芦丁含量数据 基于 SPSS 软件 采用 Pearson 相关性分析方法 考察 8 个生长 时期 7 个基因表达值与芦丁含量变化之间的线性相关 性 假设 t 检验值设置 P 0 05 使用 R 语言软件 将上述表达值和芦丁含量值标准化处理后 转化为矩 阵 采用欧式距离法绘制层次聚类热图 2 结果 2 1 基因序列特征分析 克隆获得 FtMYB7 完整 CDS 序列 其中包含 876 bp 核苷酸 编码 291 个氨基酸残基 FtMYB9 完整 CDS 序列 包含 912 bp 核苷酸 编码 303 氨基酸 保守结 构域 motif 分析表明 FtMYB7 和 FtMYB9 与苦荞所 提交的其他 MYB 基因 以及 AtMYB11 AtMYB12 和 AtMYB111 的蛋白序列中都含保守 R2 和 R3 重复 基序结构域 结构域中高度保守的色氨酸 W 残基 代表着 DNA 结合域的关键位点 图 1 氨基酸序列 同源性分析表明 FtMYB7 与其他苦荞 MYB 转录因 子氨基酸同源性范围为 41 65 FtMYB9 与其他 苦荞MYB转录因子氨基酸同源性范围为42 71 系统进化树分析 共获得 6 个亚类 其中 第 类 FtMYB7 FtMYB10 FtMYB11 FtMYB13 和 FtMYB21 和第 类 FtMYB3 和 FtMYB17 这些转录因子均与植物非生物胁迫相关 FtMYB9 FtMYB22 2 个 FtMYB1 以及 2 个 FtMYB2 聚为一类 这些基因与苯丙烷类代谢调控相关 类 拟南芥 AtMYB11 AtMYB12 和 AtMYB111 聚为第 类 已证实调控黄酮醇代谢 克隆获得的 FtMYB9 与 FtMYB like 金荞麦 FcMYB like 等序列聚为 类 而 FtMYB7 单独为聚为第 类 图 2 以上结果表 明获得 2 个新苦荞 MYB 转录因子 2 2 苦荞FtMYB7和FtMYB9表达模式 FtMYB7 和 FtMYB9 相对表达量在整个生育期存 在明显差异 图 3 FtMYB7 相对表达量呈现先升 高后下降趋势 在 S1 S3 时期 基因表达量逐步升 高 S4 时期 盛叶期 表达量略有下降 而到了 S5 时期 现蕾期 该基因相对表达量达到最高值 高 达 867 倍 说明 FtMYB7 花蕾中的表达量最高 18 期 孙朝霞等 苦荞全生育期芦丁积累与其生物合成途径相关基因表达分析 3477 随后在花 未成熟籽粒和成熟籽粒中表达量较低 在苦荞生育期的 S1 和 S2 时期 萌发期和子叶期 FtMYB9 相对表达量较高 达到 34 和 72 倍 而其 他生育期基因表达量较低 说明该基因在叶中的表 达量高于其他组织 2 3 芦丁含量与基因表达相关性分析 利用高效液相色谱法 HPLC 测定苦荞 8 个生 长时期组织中芦丁含量 结果表明在真叶和花蕾中芦 丁含量最高 分别为 7 39 和 12 95 mg g 1 DW 而在萌 发期植株 子叶和盛花组织中芦丁含量较低 分别为 阴影部分表示 R2R3 结构域中保守的色氨酸 W 表示高度保守氨基酸 Shadows represent the highly conserved tryptophan in R2R3 structure Other conserved amino acids are labelled with asterisks 图 1 FtMYB7 和 FtMYB9 转录因子 CDS 结构域分析 Fig 1 Conservative structure domain analysis of FtMYB7 and FtMYB9 本试验提交序列 The sequence submitted by this experiment 图 2 苦荞FtMYB7和FtMYB9系统进化树分析 Fig 2 The phylogenetic tree of FtMYB7 and FtMYB9 and other MYBs from F tataricum 3478 中 国 农 业 科 学 50 卷 0 50 100 150 200 600 800 S1S2S3S4S5S7S8 苦荞生育期 Developmental stages of F tataricum S6 FtMYB7 FtMYB9 1000 图 3 苦荞全生育期期FtMYB7和FtMYB9相对表达量分析 Fig 3 FtMYB7 and FtMYB9 expression levels in 8 developmental stages of F tataricum 2 56 1 46 和 1 98 mg g 1 DW 在 S8 时期 即成熟籽 粒中 芦丁含量达到 6 77 mg g 1 DW 图 4 芦丁生物合成途径 5 个关键酶基因 FtMYB7 和 FtMYB9 表达值相关性分析见表 2 FtUFGT Ft4CL FtCHS FtF3H 和 FtMYB7 的表达值与芦丁含量变化 显著正相关 相关系数分别为 0 890 0 748 0 683 0 704 和 0 862 而 FtFLS like 和 FtMYB9 表达值 与芦丁含量变化显著负相关 相关系数分别为 0 442 和 0 501 基因相对表达量层次聚类分析表明 在 苦荞全生育期 Ft4CL FtCHS 和 FtF3H 表达模式相 近聚为一类 而 FtUFGT FtMYB7 FtFLS like 和 FtMYB9 的表达趋势相近划分为另一类 除 FtFLS like 和 FtMYB9 之外 其余基因在 S3 和 S5 期相对表 达值均高于其他时期 即在真叶和花蕾中表达量最 高 图 5 芦丁含量 Rutin content mg g 1 DW 图 4 九江苦荞全生育期芦丁含量 Fig 4 Rutin content in Jiujian variety S1S2S3S4S5S6S7S8 1 0 1 2 3 Ft4CL FtCHS FtF3H FtUFGT FtMYB7 FLS like FtMYB9 图 5 苦荞芦丁合成途径相关基因表达量热图 Fig 5 Heatmap for correlated with rutin content and gene expression in F tataricum 3 讨论 苦荞属于小杂粮作物 芦丁作为苦荞中特有的黄 酮醇衍生物 其生物合成途径属于植物体内苯丙烷代 谢途径下游分支途径之一 23 尽管该生物合成途径上 关键酶基因的研究已在许多植物中有报道 24 25 但由 表 2 芦丁生物合成途径相关基因表达量与芦丁含量相关性分析 Table 2 Correlation analysis of rutin content and rutin related gene expression 基因 Gene FtUFGT FtFLS Ft4CL FtCHS FtF3H FtMYB7 FtMYB9 芦丁含量 Rutin content FtUFGT 1 0 316 0 803 0 792 0 863 0 959 0 243 0 890 FtFLS 0 316 1 0 346 0 112 0 136 0 427 0 194 0 442 Ft4CL 0 803 0 346 1 0 858 0 768 0 892 0 352 0 748 FtCHS 0 792 0 112 0 858 1 0 962 0 771 0 475 0 683 FtF3H 0 863 0 136 0 768 0 962 1 0 784 0 407 0 704 FtMYB7 0 959 0 427 0 892 0 771 0 784 1 0 203 0 862 FtMYB9 0 243 0 194 0 352 0 475 0 407 0 203 1 0 501 芦丁含量 Rutin content 0 890 0 442 0 748 0 683 0 704 0 862 0 501 1 18 期 孙朝霞等 苦荞全生育期芦丁积累与其生物合成途径相关基因表达分析 3479 于苦荞以及近缘物种基因组序列信息的缺乏 导致获 得这些关键酶基因的序列仍然比较困难 对于芦丁代 谢的分子调控机理还有待于进一步深入研究 目前研 究较多的转录因子集中在 MYB 和 WD40 两类 26 27 本研究通过二代测序技术获得苦荞叶片转录组数据 根据原始 Reads 序列拼接去冗余 获得 109 个 MYB 转录因子基因序列 采用 RT PCR 法获得 2 个 MYB 基因的完整 CDS 序列 暂命名为 FtMYB7 和 FtMYB9 结合先前克隆到芦丁生物合成途径的 5 个关键酶基 因 试图探讨苦荞全生育期芦丁含量变化与这些基因 表达之间的关系 GUPTA 等 20 研究表明 苦荞发育 阶段芦丁含量动态变化与芦丁生物合成途径上游的 PAL CHS CHI 和 FLS 表达量呈正相关 同样 本 研究也发现全生育期中苦荞植株芦丁合成积累的动态 变化与芦丁生物合成途径上游的 3 个关键酶基因 Ft4CL FtCHS 和 FtF3H 表达呈正相关 与前者 不同的是本研究中克隆到的 FtFLS like 表达在真叶和 成熟籽粒中降低 而在其他组织中都表现较高的表达 趋势 且与芦丁含量的动态变化呈负相关 这可能是 因为本研究中的 FtFLS like 与前人克隆到 FLS 为同一 基因家族中基因功能发生了分化 负责苦荞植株不同 生长时期的芦丁生物合成功能 12 同时 芦丁合成途 径最后一步关键酶 UFGT 和 MYB7 表达与芦丁含量动 态变化也呈正相关 同样有 2 个表达量最高的时期 分别是在 S3 和 S5 期 即真叶期和现蕾期 而 MYB9 与其他基因的表达模式具有明显差异 仅在 S1 和 S2 期 幼苗期 表达上调 上述结果表明 MYB7 和 MYB9 可能负责调控苦荞不同生长时期的芦丁合成 综上所 述 除 MYB9 以外 其他 5 个关键酶基因和 MYB7 均 在真叶期和现蕾期有表达峰值 而真叶期为种子萌发 转到营养生长期 现蕾期为营养生长转向生殖生长 期 这 2 个时期均属于苦荞生长发育的转折时期 此 时芦丁含量增加以及合成途径上关键酶基因上调表 达可能是由于植株叶形态和花形态建成过程中受到 体内激素极性运输和调节 导致黄酮类物质大量合 成 而最近的研究也表明 拟南芥中 WRKY23 转录 因子调节黄酮醇类物质的合成反馈抑制根部生长素 的转运最终调控根发育形成 28 拟南芥中 AtMYB11 AtMYB12 和 AtMYB111 负责调控幼苗和成株期中黄 酮醇类衍生物合成类型和合成途径关键酶基因的表 达 29 前人研究表明 FtMYB1 和 FtMYB2 参与调控原 花青素 PAs FtMYB9 和 FtMYB22 调控苦荞对盐 胁迫响应 30 本研究所克隆的 FtMYB9 与前人克隆的 FtMYB like 聚为一类 这类基因并没有明确的功能划 分 推测 FtMYB9 可能负责调控花青素或者非生物胁 迫响应的下游基因 也间接解释了该基因与全生育期 苦荞芦丁合成呈负相关性的结果 MYB 转录因子调 控苦荞黄酮醇合成关键酶基因表达及芦丁合成不同 生长时期和组织部位的分子机制仍比较复杂 尚需进 一步深入研究 4 结论 揭示了 2 个 MYB 类转录因子基因 FtMYB7 和 FtMYB9 序列具有保守的 R2R3 结构域特征 明显区别 于前人所克隆到的苦荞 MYB 基因 这 2 个基因可能 与黄酮类代谢功能相关 不同组织中 FtMYB7 和 FtMYB9 表达量与芦丁含量存在明显相关性 推测其 可能调控不同生育时期芦丁合成 References 1 KITABAYASHI H UJIHARA A HIROSE T MINAMI M On the genotypic differences for rutin content in tatary buckwheat Fagopyrum tataricum Gaertn Breeding Science 1995 45 2 189 194 2 KOES R VERWEIJ W QUATTROCCHIO F Flavonoids A colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways Trends in Plant Science 2005 10 5 236 242 3 郭彬 韩渊怀 黄可盛 路阳 侯思宇 HPLC 法测定 30 个荞麦品 种芦丁含量的研究 山西农业科学 2013 41 1 26 29 GUO B HAN Y H HUANG K S LU Y HOU S Y Researched on rutin contents among 30 buckwheat cultivars by HPLC Journal of Shanxi Agricultural Sciences 2013 41 1 26 29 in Chinese 4 CHEN Y H YANG X Y HE K LIU M H LI J G GAO Z F LIU Z Q ZHANG Y F WANG X X QIU X M SHEN Y P ZHANG L DENG X H LUO J C DENG X W CHEN Z L GU H Y QU L J The MYB transcription factor superfamily of Arabidopsis Expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family Plant Molecular Biology 2006 60 1 107 124 5 WANG Z TANG J HU R WU P HOU X L SONG X M XIONG A S Genome wide analysis of the R2R3 MYB transcription factor genes in Chinese cabbage Brassica rapassp pekinensis reveals their stress and hormone responsive patterns BMC Genomics 2015 3480 中 国 农 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山西农业 大学学报 自然科学版 2015 35 1 24 28