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牛结核病检疫方法研究进展 刘金晔 郝永清 内蒙古农业大学兽医学院 内蒙古呼和浩特 010018 摘要 牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种慢性消耗性疾病 在许多国家尤其是发展中国家仍然广泛流行 该病不 仅给畜牧业造成巨大的经济损失 而且严重威胁着人类的健康 因此 牛结核病的检疫意义重大 细菌学检测 免疫学检测 及分子生物学诊断为牛结核病检疫的研究奠定了基础 然而 目前迫切需要研究快速 灵敏 特异的牛结核病诊断方法 牛 结核病血清学诊断技术研究一直是研究热点之一 但至今仍存在许多问题 作者就这些诊断检疫方法进展作一简要介绍 关键词 牛结核病 诊断 进展 中图分类号 S852 61 8 文献标识码 A 文章编号 1671 7236 2011 05 0146 06 牛结核病是一种人畜共患传染病 可以通过吸 入含菌气溶胶或食用受污染的乳制品而从牛传染到 人 Wedlock 等 2002 结核病是最古老的疾病之 一 不仅严重威胁着人类和动物的健康 而且造成了 巨大的经济损失 Hines 等 1995 Martin 等 1994 目前世界范围内的牛结核病疫情形势严峻 约有 5000 万头牛感染了结核分枝杆菌 造成的经济损失 每年达 30 多亿美元 野生动物带菌状况更是无法精 确统计 Cousins 2001 在西方一些畜牧业发达的国家 牛群的结核病 疫情一度相当严重 经过实施 检疫 扑杀 措施 疫 情有所控制 但是在某些地区 如英国 由于自然 界中存在多种牛结核分枝杆菌的野生动物储存宿 主 近年来牛群中的结核病疫情又有所抬头 在拉 丁美洲 加勒比海 非洲 亚洲等一些不发达的地区 由于不能很好地实施相关的控制措施 牛群中的结 核病疫情正呈现渐渐蔓延的趋势 控制本病的传播 和蔓延 需及时检疫并根除病牛 因此 搞好牛结核 病的检疫和防治工作 定期对牛群进行检疫至关重 要 引起牛结核病的主要病原菌是牛型分枝杆菌 Mycobacterium bovis 属于分枝杆菌属 分枝杆 菌属包括结核分枝杆菌 M tuberculosis 牛型分枝 杆菌 M bovis 禽型分枝杆菌 M avium 等 牛 结核病的检测方法 大体上可归为三类 第一类是细 菌学检测 如涂片镜检 细菌培养 动物试验等 第二 类是免疫学检测 第三类是分子生物学诊断技术 传统的细菌学方法由于繁琐费时 检出率低 灵敏度 差 已不能满足当前疫病检疫的需要 目前世界各 收稿日期 2010 10 08 国都在致力于研究开发牛结核病的快速诊断方法 并已经建立了一些快速 准确 可靠的新型检测技 术 有些技术已经在生产实践中得到了广泛的应用 1 抗酸染色法 病料涂片后进行抗酸染色 显微镜镜检抗酸性 杆菌 本菌的细胞壁除了有肽聚糖外 还有特殊的糖 脂 因为糖脂的影响 致使革兰氏染色不易着染 但 能抵抗 30 mL L 石碳酸酒精的脱色作用 抗酸染色 为红色 陆承平 2001 常用齐尼二氏 Ziehl Neel son 染色法 也可用荧光抗酸染色法 如果组织内 有抗酸性染色的微生物 并且具有典型的组织学病 变 就可以做出初步诊断 抗酸染色法阳性率比较 低 但它作为一种传统的检测方法 具有假阳性率 低 价格低廉 操作简便等特点 常晓辉 2002 在牛 场中就可进行 所以仍有一定的实用价值 2 细菌分离培养法 用选择性培养基分离分枝杆菌 再通过培养和 生化试验来鉴定 也可采用核酸探针和聚合酶链式 反应 polymerase chain reaction PCR 方法进行检 疫 如果因培养物污染或其他特殊原因 可通过豚 鼠接种 再分离鉴定来证实 常用的培养基是罗杰 二氏 Lowen stein Jensen 培养基 改良罗杰二氏培 养基 丙酮酸培养基和小川培养基 但是 在上述培 养基中 结核菌需 14 15 h 分裂一次 这使得病原 学检查所需周期长 一般需 10 30 d 才能看到菌落 陆承平 2001 阳性率较低 所以在实际工作中很 少被采用 3 结核菌素皮内试验 此方法在长期的实践中被证明是检测牛结核病 的可靠的筛选试验 已被世界各国广泛采用 但不足 之处在于 对因感染其它分枝杆菌而致敏的动物检 146 疾病防治中国畜牧兽医 2011年第 38 卷第 5 期 测结果同样呈阳性 不能判断病情 且在那些因病情 严重而导致免疫反应低下的动物易出现假阴性 此 外 结核菌素皮内试验需要消耗大量人力 检验周期 较长 所以有一定的滞后性 由于 DTH 迟发型变 态反应 的滞后效应 此方法不能在 30 d 内重复进 行 在一些对牛群进行 BCG 免疫的国家或地区 由 于 BCG 疫苗中含有与 PPD 相同的抗原成分 因而 PPD 皮内试验不能鉴别免疫动物与感染动物 PPD 的质量和剂量 结果判定标准及操作方法等因 素均能影响检测结果 故需严格进行质量控制 在 一些国家 使用比较结核菌素试验 即比较皮内试验 single intradermal comparative tuberculin test SICT T 在颈部一侧的不同部位 同时注射M bovis PPD 和 M avium PPD 对两种PPD 的不同反应 能 够提示被检动物是 M bovis 感染还是非特异的 DTH 反应 4 血清学诊断 此类方法均利用抗原抗体反应检测针对牛结核 分枝杆菌抗原的循环抗体 目前用于检测的抗原有 PPD F5 A60 LAM lipoarabinomannan 及 MPB70 等 已经建立的诊断技术有 酶联免疫吸附 法 enzyme linked immunosorbent assay ELISA 免疫斑点测定法 dot immunoassay 荧光偏振检测 法 fluorescence polarization FPA 斑点金免疫渗 滤试验 dot immunogold filtration assay DIGFA 银加强胶体金技术 silver enhanced colloidal gold assay SECGA 免疫印迹法 Western blotting 固相抗体竞争试验 solid phaseantibody competi tiontest SACT 以及固相抗体竞 争夹心酶联法 solid phaseantibody competition test sandwich en zyme linked immunosorbent assay SACSET 等 其中 Surujballi 等 2002 首次报道通过 FPA 技术 检测牛 M bovis 感染 利用荧光标记的 MPB70 作 为抗原 检测感染牛血清中的抗 M bovis 的抗体 该法只需要荧光标记抗原一种试剂 无需分离和洗 涤步骤 操作快速 简便 可在数分钟内得到结果 且 无需大型复杂的设备 只需一台荧光偏振检测仪即 可进行现场检测 另外 据 Silva 2001 报道 将结 核杆菌AN5 菌株超声裂解 取培养液上清进行抗原 包板 用过氧化物酶标记的抗牛 IgG 的二抗 对牛 血清标本进行 ELISA 检测 其灵敏度约为 47 5 特异性高达 94 4 Amadori 等 2002 报道 将 M tuterculosis 的编码 ESAT 6 M bovis 基因组也 编码 该蛋 白 成 分 MT SA 10 有 文 献称 之 为 CFP10 PT 51 MPT63 的基因 以及 M bovis 的编 码 MPB59 MPB64 MPB70 的基因 经适当的表达 体系表达以获得相应的重组蛋白抗原 纯化后作为 包被抗原用于 ELISA 检测 通过采用多种重组抗原 组合 可以大大提高 ELISA 方法的灵敏度和特异 性 Lightbodya 等 2000 报道 通过合成肽技术分 析 MPB70 上的 B 细胞抗原表位 将人工合成的含 有这些表位的多肽用于检测 MPB70 的抗体 有助 于提高诊断的特异性 由于牛体对大多数 M bovis 的感染首先产生有效的细胞免疫 并能长期将感染 限制在局部区域使之不能扩散 因而体液免疫反应 出现较迟且往往反应低下 加之各种分枝杆菌之间 含有较多的共同抗原成分 因而导致该法的灵敏度 和特异性较低 高水平的循环抗体可见于病情恶化 之后 可能与细胞免疫失败 从而失去对分枝杆菌繁 殖的限制有关 因此 在进行 PPD 皮内试验之后应 用血清学检测方法复检 对 高危 病牛的鉴定有一 定的作用 另外 对于那些因免疫无反应性而导致 PPD 皮内试验阴性的牛体 同时应用 ELISA 等血 清学检测方法是解决这一问题的有效手段 Ama dori 等 2002 血清学诊断利用单一抗原 鸡尾酒 抗原或重组抗原作为抗原经行 ELISA 检测 试验结 果不理想 灵敏度和特异性很难达到预期目标 5 对菌体成分的检测 Dandapata 等 1999 报道了利用薄层层析技术 thin layerchromatography T LC 通 过 分 析 M bovis 的脂质成分 PGL phenolic glycolipid 与 PDIM phthiocerol dimycocerosate 可以快速对 M bovis 进行检测和鉴定 该技术只需 10 15 mg 的细菌培养物 与传统的生化鉴定方法相比具有简 便 快速的优点 因而是一种可靠的替代方法 还有 学者利用过氧化物酶标记的单克隆抗体 检测 M bovis 菌体抗原 如 MPB70 等 的免疫过氧化物 酶试验检测法 其优点是检测速度快 成本低 操作 简便 在检测分枝杆菌混合感染时尤其出色 缺点是 结果易受标本采集和病程影响 准确率比较低 6 淋巴细胞增生试验 致敏的外周血淋巴细胞 peripheral blood lym phocyte PBL 在 特异性抗原 如 PPD MPB70 MPB64 和 MPB59 等 刺激下 可使抗原特异性 T 淋巴细胞亚群发生增生反应 经典方法使用同位素 147 中国畜牧兽医 2011 年第 38 卷第 5 期疾病防治 对合成 DNA 必需的某种核苷酸进行标记 最近有 报道使用 5 溴脱氧尿苷 5 bromo deoxyuridine Br dU 替代同位素标记的胸腺嘧啶核苷 BrdU 是一 种胸腺嘧啶核苷的类似物 可取代胸腺嘧啶核苷参 与 DNA 的合成 被结合的 BrdU 可由荧光标记抗 BrdU 抗体识别并结合 配合流式细胞仪可以对其 进行识别并计数 通过测定外周血循环中的增生淋 巴细胞的比例可了解淋巴细胞增生的程度 间接反 映淋巴细胞被特异性抗原致敏的情况 从而分析动 物机体对 M bovis 的细胞免疫状态 该方法虽然能 有效地监测牛结核个体的发病和免疫情况 但不适 用于大规模牛结核疫情的检测 7 细胞因子及细胞因子受体检测法 这类方法的原理是 通过检测抗原特异性的 T 淋巴细胞在体外接受相应抗原刺激活化后分泌的 T 淋巴细胞活化标记分子 如 IFN IL 2 IL 2R 等 可以判断机体对某种病原的致敏情况 从而间 接反映是否被该病原感染 与 PPD 皮内试验相比 具有出现反应早 在牛被感染后 2 3 周即可得到阳 性结果 试验快速 灵敏的优点 Rhodes 等 2000 7 1 干扰素 IFN 检测 此方法由 Wood 等于 1990 年建立 其原理为致敏的 PBL 在体外培养的 条件下 接受特异抗原 如 PPD 刺激后被活化 表 达并分泌 IFN 通过一定的技术手段对培养上清 中的 IFN 进行检测 如 ELISA 或者对 IFN mRNA 的表达进行定量或者半定量 如 RT PCR 检测 还通过 ELISPOT 技术对分泌 IFN 的淋巴 细胞进行计数 形成的斑点数 及对单个细胞分泌的 IFN 进行定量 形成的斑点大小 检测 其结果与 淋巴细胞增生试验具有很好的相关性 Anthony 等 2003 目前在西方国家得到普遍应用的是 ELISA 方法将 1 0 mL 的肝素抗凝血液和 PPD 在 37 培 养过夜 第二天收集血浆样品并以夹心 ELISA 检测 IFN Ng 等 1997 用作全血培养刺激物的抗原 是 M bovis 的 PPD 和 M avium 的 PPD 后者用于 检查交叉反应 该测定系统简便 快速 便于用作 疫情监测时大量样品的测试 而目前国内 IFN 检测 ELISA 试剂盒大多需 要从国外进口 价格较高 因而国内牛结核检疫的 研究主要集中于牛 IFN 单克隆抗体的制备 而这 一环节的难题在于如何提高小片段蛋白的生物活性 及免疫原性 后期难点在于如何建立对其免疫原性 的有效检测方法 目前 秦爱建等已率先研制出牛 结核 IFN 单克隆抗体 建立了快速检测牛结核方 法及检测试剂盒 其在诊断效果上毫不逊色于国外 技术 成本却只有国外产品的 1 4 打破了国外进口 垄断 与结核菌素皮内试验相比 IFN 测定法不仅 简单 快速 灵敏度和特异性 尤其是后者 高 而且 由于减少了前者试验中操作和解释上的主观性 使 结果更为客观 可靠 而且 据 Ryan 等 2000 报 道 在皮内试验进行后再进行 IFN 试验 其灵敏 度和特异性未有显著影响 分别为 85 和 93 因 此可以作为皮内试验理想的补充试验 最近的研究 结果发现 用 ESAT 6 由 M tuberculosis 和 M bovis 分泌的一种小分子质量分泌性抗原 BCG 和其它环 境分枝杆菌不能分泌 作为刺激抗原 可以大大减少 交叉反应 从而显著提高该方法的特异性 使用 BCG 对牛群进行免疫接种并不会影响对疫情的监 测 因此能够并行实施疫情监测计划和免疫接种计 划 所以该方法尤其适用于那些对牛群进行 BCG 接 种的国家或地区 Buddle 等 2001 1999 有证据 表明 ESAT 6 是 M bovis 感染早期的种优势抗原 使用该抗原有助于早期诊断牛结核病 牛 IFN 试验的大范围田间试验已在世界上许多国家 包括 澳大利亚 爱尔兰 比利时 新西兰 阿根廷 西班牙 意大利和美国 完成 并在澳大利亚 爱尔兰和新西 兰被批准为正式试验 以 PPD 作为抗原 该法灵敏 度约为 89 3 特异性约为 92 2 Pollock 等 2000 若以 ESAT 6 作为刺激抗原 虽然灵敏度有 所下降 约 76 3 其损失的一部分灵敏度原本就 是由 PPD 交叉反应所导致的假阳性 但是特异性 可达 99 2 Pollock 等 2000 2001 年 Vorder meier 等 2001 报道 通过使用混合了 ESAT 6 和 CFP 10的 鸡尾酒 抗原进行刺激 可使该试验的特 异性达到 100 诊断上的高特异性将大大降低大 规模实施 检疫 扑杀 计划的经济成本 从而有利 于这一计划的大范围推广实施 7 2 白细胞介素 2 IL 2 检测 IL 2 主要由活化 的 T 淋巴细胞分泌 与 IFN 一样 也是参与细胞 免疫反应的重要细胞因子 同样可以作为 T 淋巴细 胞细胞介导的免疫反应的指标 Ng 等 1997 利用 IL 2 具有刺激成淋巴细胞 Lymphoblast 增生的特 性 通过 Lymphoblast 增生试验 测定牛 PBL 经抗 148 疾病防治中国畜牧兽医 2011年第 38 卷第 5 期 原刺激培养后的上清中 IL 2 的生物活性 以重组人 IL 2 建立的标准曲线作对照 可以对全血培养物上 清中的 IL 2 活性进行半定量 同时 他们还通过半 定量 RT PCR 测定经过刺激培养的牛 PBL 的 IL 2 mRNA 的 表达 量 有学 者通 过化 学发 光技 术 chemiluminescence 测定 IL 2 mRNA 的表达量 以及通过光密度扫描 densitometric scanning 或竞 争 PCR 技术对其进行精确定量 7 3 白细胞介素 2 受体 肽链 IL 2R 的检测 IL 2R 是组成 IL 2 受体的一条肽链 静止状态的 T 淋巴细胞仅表达低水平的 IL 2R T 淋巴细胞 被活化后 其细胞膜上的 IL 2R 表达量增高 使这 些分子以可溶形式释放 可能与特异性蛋白酶水解 导致的切割有关 ELISA 检测经特异抗原 如 PPD ESAT 6 等 刺激后的牛外周血或脾脏淋巴细 胞释放的 IL 2R 可以了解动物机体对 M bovis 的细胞免疫状态 Pollock 等 2000 8 聚合酶链反应 PCR 技术 Sechi 等 1999 从牛结核分枝杆菌核酸序列 IS1311 和 IS1245 中分别选择一段高度保守的区域 设计引物对样本进行扩增 由于不同分枝杆菌基因 组中插入序列的不同 可以鉴别多种分枝杆菌 且结 果具有很好的稳定性和重复性 Miller 等 2002 报 道对结核分枝杆菌复合群 M tuberculosis com plex 的 IS6110 和 M avium 的 16S rRNA 和 IS900 序列设计引物 能从组织中一次检测出这两类分枝 杆菌 该试验秉承了 PCR 技术高度灵敏的特性 而 且通过对不同的特异区段设计相应引物 能够鉴别 各种分枝杆菌 最近 Ritelli 等 1999 发现 可以将 人巨噬细胞系 T HP 1 该细胞具有 Fc 和 C3b 受体 缺乏膜表面及胞浆免疫球蛋白 易于培养且对 M bovis 易感 是扩增牛 M tuberculosis 复合群的 有效媒介 用来从临床样本中分离和增殖分枝杆菌 经过 48 h 培养可以将微量的分枝杆菌大量增殖 收集培养后的细胞 随后可以通过半巢式 semi nested PCR 检测被感染的 T HP 1细胞中牛 M tu berculosis 复合群特异性的插入序列 IS6110 或者通 过流 式细 胞 仪 检 测分 子 伴 侣 chaperonin 10 cpn10 也有人称之为 HSP10 或 MPB57 为 M tu berculosis 和 M bovis 所特有 的表达和分泌 从而 检测 M bovis 9 核酸探针技术 Gormley 等 1997 将 M paratuberculosis 基因 组上一段长度为 165 bp 含有 PAN 启动子的 DNA 片段进行放射性标记并将其作为探针 提取待测菌 株的 DNA 经限制性内切酶 EcoR 消化 Southern 印迹后与探针进行杂交 该方法综合利用了 EcoR 的限制性酶切片段长度多态性 RFLP 技术和 DNA 探针技术 能够从混合样品中一次检出 M tu berculosis M bovis M avium 和 BCG 等多种致病 或非致病分枝杆菌 同样的方法 Bigi 等从 M bovis 的野生菌株中克隆一段 DNA 重复序列 属于富 G C 多态性重复片段 将该序列作为 DNA 探针 可 以对 M bovis 的基因型进行鉴定 并可用于牛结核 病的流行病学研究 Romano 等在 RFLP 的基础 上 利用两个分子标记 一个与 IS6110 相邻的正向 重复序列 direct repeat DR 和一个称作 pMBA2 的富 G C 多态性重复片段 用限制性内切酶 A lu 消化 可以对不同地区的 M bovis 分离株进行鉴定 并对牛结核病进行流行病学监测 该方法的主要缺 点在于需要进行多次杂交 工作量大 费时费力 Kamerbeek 等 1997 建立了间隔区寡核苷酸 分型技术 spacer oligonucleotide typing Spoligoty ping 用以检测 M bovis 它是利用一段特定的间 隔区寡核苷酸与体外扩增得到的 DR 序列杂交 这 种杂交具有菌株特异性 因而可以同时对 M bovis 的各个菌株进行快速的鉴定和鉴别 还可鉴别 M bovis 和M tuberculosis 该方法只需要少量的 DNA 并可直接利用细菌裂解物进行试验 无需进 行细菌的传代培养和提取 DNA 结果分析也相当简 便 Milian Suazo 等 2002 尝试利用该方法 对墨 西哥境内的 M bovis 的基因型进行地理定位 结果 表明如果没有流行病学信息的支持 仅仅分析基因 型难以追溯 研究疫情的来源 Roring 等 2000 在 Spoligotyping 技术的基础上 结合运用序列捕获 sequence capture PCR 技术 目的是富集样本中的 细菌 DNA 可以直接从组织样本中检测一组间隔 区寡核苷酸型 spoligotype ST 模式 从而可以快 速检测出 M bovis 10 应用噬菌体生物扩增技术检测牛结核分枝杆菌 建立噬菌体生物扩增技术检测牛结核分枝杆菌 方法 比较各种检测方法对测定结果的影响 其结果 为 噬菌体工作浓度为 1 108PFU mL 37 感染 2 h 杀毒剂浓度在 100 mmol L 室温作用 10 min 为最佳检测条件 添加指示细胞浓度在 1 10 6 条 mL 时 形成噬菌斑清晰 便于计数 在选择最佳测定条 件下 噬菌体生物扩增法检测牛结核分枝杆菌快速 简便 灵敏 刘子芝等 2008 通过对牛结核分枝杆 149 中国畜牧兽医 2011 年第 38 卷第 5 期疾病防治 菌的稀释 进行噬菌体检测的灵敏度试验 并与常规 细菌培养方法的比较 牛分枝杆菌的活菌数为 200 300个 mL 即可被检出 因此具有较高的灵敏度 特异性试验结果表明只有结核分枝杆菌和牛型分枝 杆菌才出现阳性结果 而副结核杆菌 鸟分枝杆菌和 3 种常见菌检测结果均为阴性 说明该方法对牛结 核病的病原检测特异性达到 100 朱梅芬 1991 而检测时间 2 4 d 明显低于传统方法培养所需要 的时间 2 3 个月 由上述研究结果可看出 在选 择最佳测定条件下 噬菌体生物扩增法检测牛结核 分枝杆菌 快速 简便 灵敏 特异性强 是一种较理 想 对牛结核病有诊断及治疗意义的新方法 同时 由于噬菌体的裂解作用 试验过程中能将样本中活 的牛结核分枝杆菌杀死 有利于实验室的生物安全 性 而且无需昂贵的仪器设备 成本低廉 适于牛结 核病基层检疫应用 11 小结 综上所述 由于分子生物学检测需要特殊的仪 器设备 技术相对复杂 对实验室条件和操作人员的 要求比较高 现阶段还较难在生产实践中普遍推广 免疫学检测虽然简单易行 但由于目前试剂昂贵 导 致大规模实施的成本过高 落实推广尚有待时日 迄今为止 经典的 PPD皮内试验依然是唯一得到公 认的标准检测方法 但其不足也是显而易见的 因而 临床上迫切需要新的诊断技术和标准 目前比较一 致的观点是 一方面对 TT 试验进行适当的改进 如 国内外均有用分枝杆菌重组抗原代替 PPD 进行皮 内试验的报道 同时选择一种或几种检测技术与 TT 试验形成组合 互相取长补短 以尽可能的提高 检测的灵敏度和特异性 大量的研究结果和实践证 明 体外检测特异性细胞因子 主要是 T h1 型细胞 因子 如 IFN IL 2 等 的方法是早期诊断牛结核 病的有力手段 Rhodes 等 2000 在已经建立的这 类试验中 以 ELISA 的应用最为成熟和普遍 而 据 Favre 等 1997 对半定量 RT PCR ELISA 和 ELISPOT 这 3 种方法测定 IFN 进行的比较试 验 结果表明 ELISA 的灵敏度最低 可能与 IFN 的旁分泌有关 其余两种方法不受影响 目前 应 用 ELISPOT 方法检测细胞因子 尤其是 IFN 已 经在医学领域得到了广泛应用 在疫病检测领域也 具有广阔的应用前景 在各种细胞因子检测试验 中 PPD 被广泛用作刺激抗原 但是由于 PPD 只 是粗提物 其抗原不易标准化 不同来源的商品化 PPD 抗原成分不一 且与其他非致病分枝杆菌含有 共同抗原组分 导致出现交叉反应 这些均能导致结 果的差异 T ameni 等 1998 随着基因工程技术的 不断发展 利用基因重组和表达技术 可以方便的得 到各种已知基因序列的蛋白抗原成分 研究结果表 明 应用基因工程技术生产的能被 T 淋巴细胞识别 的纯化 重组抗 原 如 ESAT 6 MPB64 MPB70 MPB59 Ag85B 等 Buddle 等 1999 Gormley 等 1999 尤其是那些 BCG 不能产生的抗原 如 ES AT 6 CFP 10 等 Pollock 等 2000 Mustafa 等 2002 及其它非致病分枝杆菌不能产生的抗原 如 ESAT 6 CFP 10 MPB64 等 Buddle 等 1999 作 为刺激抗原 能够显著提高检测效果 参考文献 1 王志梅 贾广乐 王建波 等 牛结核病病原体研究进展 J 中国 畜牧兽医 2010 37 3 207 210 2 刘子芝 赵勇 刘纪艳 等 应用噬菌体生物扩增技术检测牛结核 分枝杆菌的方法研究 J 中国动物检疫 2008 25 10 20 21 3 朱梅芬 应用噬菌体法检测实验动物中的绿脓假单胞菌 J 中国 生物制品学杂志 1991 4 2 13 4 陆承平 兽医微生物学 M 第 3 版 南京 中国农业出版社 2001 331 336 5 常晓辉 临床 5 种检测结核分枝杆菌方法的比较研究 J 上海 医学检验杂志 2002 17 4 226 229 6 Amadori M Lyashchenko K P Gennaro M L et al Use of re combinant proteins in antibody tests for bovine tuberculosis J Vet Microbiol 2002 85 4 379 389 7 Anthony D D Lehmann P V T cell epitope mapping using the ELISPOT approach J Methods 2003 29 3 260 269 8 Buddle B M Parlane N A Keen D L et al Differentiation be tween Mycobacteriumbovis BCG vaccinated and M bovis infected cattle by using recombinant mycobacterial antigens J Clin Di agn Lab Immunol 1999 6 1 1 5 9 Buddle B M 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