碱性磷酸酶的活力测定(修改版).ppt

血清碱性磷酸酶活性测定 磷酸苯二钠法 问题1 为何要测定血清中酶的活性 有什么意义 酶活性测定是目前临床酶学分析最为常用的方法 酶测定约占目前临床生化总工作量的1 4到1 2 用于诊断的酶类已超过100多种 常用的数十种 血浆酶 血浆特异酶 非血浆特异酶 外分泌酶 细胞内酶 一 血浆特异酶 在血浆中发挥特定催化作用的酶 如凝血酶 胆碱酯酶 CHE 脂蛋白脂肪酶 铜氧化酶等 它们大多数在肝内合成 在血浆中的浓度甚至超过器官细胞内浓度 有的可以作为肝功能试验的一部分 血浆特异酶活性的改变 除了反映血液功能外 还反映来源器官的功能 二 非血浆特异酶 在血浆中浓度很低 且无功能 分为两种 1 分泌酶 来源于消化腺或其他外分泌腺的酶 如 淀粉酶 AMY 前列腺酸性磷酸酶 ACP 脂肪酶 LPS 胃蛋白酶原 胰蛋白酶原 ALP等 正常体液中外分泌酶活性低而稳定 不发生催化作用 在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有关 来源增加或排泄受阻时 血浆中此类酶活性增高 例如 急性胰腺炎时 血淀粉酶就会升高 2 代谢酶 细胞酶 在细胞内发挥催化功能的酶 正常时这些酶存在于组织细胞中 血浆中酶活性很低 细胞内 外浓度差异悬殊 当酶来源的组织细胞发生病变 细胞膜通透性增加或细胞坏死时 细胞内酶大量进入血浆 导致血浆酶活性显著增高 其下降的临床意义很少 这一类酶临床应用较多 如转氨酶 乳酸脱氢酶 肌酸激酶等 它们在肝病 心脏疾病时都可能出现变化 一些酶在不同器官 组织 细胞内的分布和定位存在明显差异 而且在细胞内外有明显浓度梯度差 正常情况下血浆中酶活性相对恒定 但一些病理情况常导致血浆中酶活性的改变 性别 年龄 运动 妊娠 人种及环境因素等可引起人血浆中某些酶的生理性变化 所以酶与其它指标相比具有更高的诊断特异性和灵敏度 诊断常用血清酶 血清酶符号来源 鸟氨酸氨基甲酰转移酶OCT肝卵磷脂胆固醇酰基转移酶LCAT肝谷氨酸脱氢酶GLDH肝山梨醇脱氢酶SDH肝丙氨酸氨基转移酶ALT肝 肾 心异柠檬酸脱氢酶ICD肝 胎盘 心 谷氨酰转肽酶 GT肝 胆 肾 小肠5 核苷酸酶5 NT肝 胆道单胺氧化酶MAO肝 肾 脑天门冬氨酸氨基转移酶AST心 肝 骨骼肌肌酸激酶CK骨骼肌 心 脑乳酸脱氢酶LDH心 肾 骨骼肌 肝 肺碱性磷酸酶ALP骨骼 牙齿 肝 肾酸性磷酸酶ACP前列腺 红细胞 血小板淀粉酶AMS胰 唾液腺脂肪酶LPS胰 碱性磷酸酶 Alkalinephosphatase ALPorAKP ALP几乎存在于机体各个组织 但以骨骼 牙齿 肝脏和肾脏中含量较多 儿童期含量尤其多 ALP有六种同功酶 其中AKP1 AKP2 AKP6来自肝脏 AKP3来自骨细胞 AKP4产生于胎盘及癌细胞 而AKP5来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞 临床上测定ALP活性主要用于肝脏疾病和骨骼疾病的诊断 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液 同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍 反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶 即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去 并生成磷酸根离子和自由的羟基 这类底物包括核酸 蛋白 生物碱等 而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化 碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力 什么是ALP 问题1 为什么要测定碱性磷酸酶的活性 有什么意义 1 生理性增加 如儿童 妊娠期 进食高糖 高脂肪食物等均可使血清ALP活性增高 2 病理性改变 升高 1 肝胆疾病 主要见于阻塞性黄疸 急 慢性黄疸性肝炎 肝癌等均可引起血清ALP活力不同程度的升高 其中以癌性梗阻最明显 2 各种骨骼疾病 ALP主要由成骨细胞产生 故骨骼病特别是有新生骨质生成时 血液内ALP活性增加 以促进磷酸盐的沉积 如佝偻病 纤维性骨病 成骨不全症 骨转移癌和骨折修复愈合期等均引起血清ALP活力升高 降低 主要见于呆小症 磷酸酶过少症等 问题2 如何测定酶活性 酶活性 酶催化某一化学反应的能力常用单位时间内底物的减少量或产物的生成量 即酶促反应速度 来表示酶活性大小 注 在实际测定酶促反应速度时 以测定单位时间内产物的生成量为好 固定时间法 终点法 通常是酶作用一段时间后 加入强酸 强碱 蛋白沉淀剂等终止酶促反应 测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量 计算酶促反应的平均速度 连续监测法 速率法 连续监测法是指每隔一定时间 2 60s 连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据 求出酶反应初速度 间接计算酶活性浓度的方法 适用于自动生化分析仪能动态观测酶促反应进程 结果准确可靠 标本和试剂用量少 可在较短时间内完成测定 酶偶联测定法 应用 对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应 ExEaEiABCP 式中A为底物 B C为中间产物 P为产物 必须能够直接测定 Ex为待测酶 Ea Ei都为工具酶 按照工具酶作用的不同 Ea又称为辅助酶 Ei又称为指示酶 CP称为指示反应 问题3 在酶促反应进程中 是否任一阶段的酶促反应速度都可以代表酶活性 酶促反应进程曲线 能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度 即酶促反应初速度 酶的含量 酶活性 酶促反应初速度 问题4 测酶活性应注意哪些方面 合适的底物与最适底物浓度底物浓度远远高于酶浓度理想的缓冲液与最适离子强度最适温度最适pH合适的辅因子 激活剂浓度合理的测定时间对于固定时间法 需在酶作用一段时间后 加入合适的终止剂终止酶促反应 尽量去除各种抑制剂 问题5 如何表示酶活性大小 酶活性单位 定义 在一定条件下 一定时间内将一定量的底物转化为产物 或得到一定量的产物 所需要的酶量 分类 惯用单位 酶活性测定方法的建立者所规定的单位 国际单位 Internationalunit IU 指在规定条件 最适pH 最适底物浓度 下 每分钟转化1 mol底物的酶量 单位为IU L Kat单位 指在规定条件下 每秒钟转化1mol底物的酶量 1Kat 6 107IU 酶的活力单位国际单位 Katal 1s转化1mol底物的酶量临床表示 Kings 如血清谷丙转氨酶活力单位 每100ml血清在37 pH 7 4的条件下与底物作用60min 生成1 mol丙酮酸所需的酶量为1个活力单位酶的比活力 单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶活力单位数 即酶活力浓度 酶活力的测定方法1 终止测定法 定时法或终点法 2 动力学分析法 连续监测法或速率法 目录 ONTENTS C 贰 实验原理 叁 实验器材与试剂 肆 实验操作 壹 实验目的 熟悉血清碱性磷酸酶活性的测定方法 磷酸苯二钠法 掌握血清碱性磷酸酶测定的临床意义 贰 实验原理 测定ALP活性的方法主要分为两种一是测定底物解离下的磷酸根来计算酶活力 如 甘油磷酸钠法 但存在血清本身有磷酸根的缺点二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物 这种方法又可分为 酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定 如本次实验方法 生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色 如对硝基苯磷酸二钠 PNPP 法 无色的对硝基苯磷酸二钠在ALP的作用下 生成在405nm处有特异吸收的淡黄色对硝基苯酚 通过测定在405nm处吸光度的变化速率来计算ALP的活性 磷酸苯二钠法 在pH10环境中 ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠 苯酚在碱性溶液中与4 氨基安替比林作用 经铁氰化钾氧化生成醌衍生物 可根据红色深浅测定酶活性的大小 4 氨基安替比林 铁氰化钾 苯酚 红色醌亚胺衍生物 磷酸苯二钠 H2O ALP PH 10 苯酚 磷酸氢二钠 叁 实验器材与试剂 一 器材 5ml移液管 1ml移液管 100或200ul微量可调式移液器 721E分光光度计 1cm比色皿 37 恒温水浴 二 试剂 1 碳酸盐缓冲液 0 1mol L pH10 0 溶解无水碳酸钠6 36g 碳酸氢钠3 36g 4 氨基安替比林1 5g于蒸馏水800ml中 将此溶液转入1L容量瓶内 加蒸馏水到刻度 棕色瓶中贮存 2 20mmol L磷酸苯二钠溶液先将500ml蒸馏水煮沸 迅速加入磷酸苯二钠2 18g 磷酸苯二钠如含2分子结晶水 则应称取2 54g 冷却后加氯仿2ml防腐 在4 冰箱保存 用剩的溶液不应再倒回瓶中 淡黄色结晶 熔点109 溶于水 苯和乙醇 微溶于乙醚 3 铁氰化钾的硼酸溶液称取铁氰化钾2 5g 硼酸17g 各自溶于蒸馏水400ml中 两液混合后 加蒸馏水至1L 置棕色瓶中避光保存 如出现蓝绿色即弃去 4 酚标准工作液 0 05mg ml 购买合格的二级标准品 4一氨基安替比林用量与吸光度成正相关 需准确加入 铁氰化钾用量不足时 反应不完全 测量结果偏低 因此铁氰化钾用量必须加足或稍稍过量 本实验采用终止法 终止剂是铁氰化钾硼酸液 硼酸改变了PH 使其不再处于最适PH 肆 实验操作 立即混匀 用510nm波长 红色醌物质的最大吸收波长 比色 以蒸馏水调零点 读取各管吸光度 保持反应时温度是均衡的 37 C 取试管4支 按下表操作 实验过程两次水浴保温 一次5min 一次15min 前者是达到最适温度 后者是反应时间 1 2 单击此处编辑您要的内容 建议您在展示时采用微软雅黑字体 本模版所有图形线条及其相应素材均可自由编辑 改色 替换 更多使用说明和作品请详阅模版最末的使用手册 单击编辑标题 单击此处可编辑内容 根据您的需要自由拉伸文本框大小 单击此处可编辑内容 根据您的需要自由拉伸文本框大小 注意事项 1 铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的作用 此液应避光保存 如出现蓝绿色即作废 2 底物液中不应含有酚 如含有酚时空白管显红色 说明磷酸苯二钠已开始分解 不宜继续使用 3 加入铁氰化钾后必须迅速混匀 为了改变PH来终止酶促反应 否则对实验结果有影响 偏大 4 一般血清标本可以共用对照管 黄疸血清及溶血血清应分别作对照管5 目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶 开后不能久置 计算 ALP活性 A测定 A对照 A标准 A空白 0 05 100 金氏单位 金氏单位定义每100ml血清在37 与底物作用15分钟 产生1mg酚为1个金氏单位 参考值成人 3 13金氏单位儿童 5 28金氏单位 临床意义 血清中ALP活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标 1 血清ALP活性升高可能原因如下 肝胆疾病 阻塞性黄疸 急性或慢性黄疸性肝炎 肝癌等 骨骼疾病 由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中 引起血清ALP活性增高 如纤维性骨炎 成骨不全症 佝偻病 骨软化病 骨转移癌和骨折修复愈合期等 2 血清ALP活性降低比较少见 主要见于呆小病 重症慢性肾炎 乳糜泻 贫血 恶病质等 另有一种遗传性低ALP症 因成骨细胞中缺乏ALP 引起骨中的矿物质严重缺乏 易发生骨折 标准曲线法 磷酸对硝基酚连续监测法以磷酸对硝基酚为底物 2 氨基 2 甲基 l 丙醇或二乙醇胺为磷酸酰基的受体 在碱性环境下 ALP催化无色磷酸对硝基酚水解产生游离的对硝基酚 对硝基酚在碱性溶液中转变成黄色 根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位 反应需要Mg2 作为激活剂 立即混匀 选择波长510nm 用零号管调零