「BCA法和考马斯亮蓝法测蛋白质浓度」.doc

分光光度法介绍分光光度法是利用溶液中特定溶质的光吸收测定其浓度的方法，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。一 Lambert定律当一束平行单色光垂直照射于一均匀物质溶液时，溶液将吸收一部分光能，使光的强度减弱。若溶液的浓度不变，则在溶液中的光程越长，光线强度的减弱也越显著。设：入射光强度为I0，透射光强度为I，L代表光在溶液中的光程。lg=K1LK1是常数，受光线波长，溶液性质，溶液浓度影响。二 Beer定律当一束光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若光程不变，则溶液的浓度越大，光吸收越强，透射光强度的减弱也越显著，光线减弱的比例与溶液浓度呈正比。lg=K2CK2为吸收系数，是常数。溶液对光吸收的强弱与溶液浓度C成正比。三 Lambert-Beer定律将以上两个定律合并：lg=KCL令A=lg T= 则A=KCL=-lgTT为透光度，A为吸光度，K为消光系数四 待测样品浓度的计算A标=KC标L A样=KC样L由于是同一物质及相同的光程，则：A样/A标=KC样L/KC标L=C样/C标 即：C样=（A样/A标）*C样故已知标准溶液的浓度及吸光度，依据公式可计算出待测样品溶液的浓度。一 实验名称： BCA法测定蛋白质含量二 实验原理：BCA即二奎碄甲酸。在碱性条件下，蛋白的肽键结构将二价铜离子还原为亚铜离子，亚铜离子与BCA试剂形成稳定的紫色络合物，并在562nm处有最大的光吸收值，该复合物颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，故可通过吸收值的大小对蛋白质进行定量。三 实验步骤：A 标准品的稀释：将9支干燥的1.5ml离心管编号，按表加入下列试剂：BCA法标准曲线和样品测定1.2ml离心管ddH2O（L）2mg/mLBSA（L）蛋白质终浓度（g/mL)A050L标准品2000B125375L标准品1500C325325L标准品1000D175175LB管混合液750E325325LC管混合液500F325325LE管混合液250G325325LF管混合液125H400100LG管混合液25I40000=BlankB 配置BCA工作液： 依据样品数量，将试剂A和试剂B按体积比50:1配制适量BCA工作液，并充分混匀。C 标准品及样品的测定： 1）分别取25L上表中新鲜配制的BSA标准液和待测样品，加入到微孔板中； 2）每孔中加入200LBCA工作液，并充分混匀； 3）加盖，37孵育30min后冷却至室温或室温放置2h； 4）以I号管调零点，于562nm处测定各管吸光度 5）以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线。计算样品的蛋白浓度。四 实验结果：实验数据如下：ASTANDARD C1.8311.95120001.3371.45715001.0311.25110007500.6110.7555000.3290.4492500.1620.2821250.0490.1692500.1200.6030.723（加粗数据是样品吸光度）将样品数据代入方程：得出：x=726.89g/mL，即样品中的蛋白质浓度为726.89g/mL五 讨论：1从标准曲线中可以看出，溶液的蛋白质含量和吸光度成正相关，蛋白质含量越高，吸光度就越高。2 配制溶液时一定要细心，不要配错，正确使用移液枪，及时换枪头，避免污染；3 当离心管中已经注入溶液，小心不要因为过失而导致其漏液，造成损失；4 测定吸光度时注意调整波长；5 该方法快速，灵敏度高，试剂稳定性好，对不同种类蛋白质的检测的变异系数小，而且BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中化学物质的影响，低浓度的去垢剂不影响检验结果，在微孔板中进行测定，可以大大节约样品和试剂用量。6 此种方法的测定范围是202000g/mL一 实验名称：考马斯亮蓝法测定蛋白质含量：二 实验原理：考马斯亮蓝在酸性条件下和蛋白质结合，使染料最大吸收值从465nm变为595nm，在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。测定范围为50g-1000g/ml三 实验步骤：A 考马斯亮蓝染液在使用前应平衡温度至室温并温和的颠倒混匀；B 标准品的稀释： 将7支干燥试管编号，按表加入下列试剂：考马斯亮蓝法标准曲线和样品测定试剂0123456BSA液（l）2mg/ml05102030600PBS(l)15014514013012090150蛋白质终含量（mg/mL)00.0670.130.270.40.80C 标准品及样品的测定 1）将5L体积的样品加入到试管中，并用PBS补足到150L； 2）向各个试管中加入2.85mL考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5-10min； 3）以0号管调零点，于595nm处测定各管吸光度； 4）以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线。计算样品的蛋白浓度。四 实验结果：标准曲线：样品对应的吸光度为1.148将样品数据代入方程：得出：x=949.6g/mL，即样品中的蛋白质浓度为0.9496mg/mL五 讨论1 考马斯亮蓝可以和石英比色皿产生强烈的结合，建议使用玻璃或塑料比色皿；2 不同的蛋白可以和CBBG的结合程度不同，因此使用被测蛋白作标准曲线，可以得到更准确的结果；3 应按蛋白浓度从低到高的顺序进行测定，测定过程请连续进行，不要清洗比色皿，因为水质会影响测定结果；4测定吸光度时注意调整波长；5从标准曲线中可以看出，溶液的蛋白质含量和吸光度成正相关，蛋白质含量越高，吸光度就越高；6此种方法的测定范围是501000g/mL；7使用分光光度计时，每一次打开盖子后，都需要再次矫正，不然会产生误差；8在使用可见光分光光度计时，注意往装液体时不可过多，以防洒出损伤仪器。也不能过少，可能导致无法测量液体的分光度；9 由考马斯亮蓝法测得的蛋白质浓度和用BCA法测得的蛋白质浓度有很大差距，原因我们分析有以下几点： 1）我们可能在操作的过程中没有注意细节，比如试管中残留的蒸馏水没有完全除去，或者比色皿中的残留