中国药品检验标准操作规范2010年版104无菌检查法.doc

无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常验证还需对试验环境进行监控。菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。第一部分 准备及保障1 洁净室（区）的要求无菌检查的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，操作环境的无菌保障程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室（区）的环境质量采取合理的控制措施和评价方法是必要的。无菌加查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。洁净室（区）应采光良好、避免潮湿。远离厕所及污染区。由12个缓冲间和操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间与缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。在缓冲间内应有拖鞋、无菌衣放置架和挂钩等，缓冲间可设手消毒设备，不应放置培养箱和其他杂物；洁净室（区）内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间和缓冲间内不应安装下水道。无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制1826，相对湿度40%60%。缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外线灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。洁净室（区）内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。缓冲间和操作间所设置的紫外线杀菌灯（22.5Wm-3），应定期检查辐射强度，要求在操作面上达40Wcm-2。不符合要求的紫外线灯应及时更换。洁净室（区）应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭或2%甲酚液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，开启无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时。洁净室（区）的洁净度检查 洁净室（区）的洁净级别，应首先满足医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法所规定的悬浮粒子标准。洁净室（区）在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数，以此来判断洁净室（区）是否达到规定的洁净度，应按沉降菌和浮游菌所规定的测试方法执行。同时，应动态跟踪监测表面接触菌和手套菌。悬浮粒子测试方法及标准：本方法采用计数浓度法，即通过测试洁净环境内单位体积空气中含大于或等于某粒径的悬浮粒子数，来评定洁净室（区）的悬浮粒子洁净度级别。洁净室（区）的测试人员应选择与生产操作的空气洁净度级别要求相适应的穿戴方式，测试仪器必须按照仪器自身的检定周期，定期对仪器作检定。应使用检定合格，且在使用有效期内的仪器。应注意避免测试仪器对待测洁净环境的污染，必要时对仪器进行表面清洁消毒，或使用无菌的仪器罩。也可在相应的洁净室内准备和存放。测试宜在操作人员撤离现场且净化空气调节系统正常运行时间不少于30分钟后开始，采样点数目及其布置应力求均匀，并不得少于最少采样点数目，悬浮粒子测试最少采样点数目参考以下公式：NL=式中 NL为最少采样点；A为洁净室或被控洁净区的面积（m2）。对任何小洁净室（区）或局部空气净化区域，采样点的数目不得少于2个，总采样点次数不得少于5次。每个采样点的采用次数可以多于1次，且不同采样点的采用次数可以不同。悬浮粒子检测结果应满足粒径0.5m的粒数不得超过3.5个/L，5m的粒数为0，空气流速应0.35m/s，应根据检测结果定期更换空气过滤装置。沉降菌检测方法及标准；以无菌方式将3个大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或其他用户认可并经验证了的培养基平板带入无菌操作室，在操作区台面左、中、右各放1个；（或按其他采样点布置方式设置采样点数目及位置，采样点数目可参考悬浮粒子所规定之内容，采样点计划参见附录A）；逐一打开碟盖正置，使培养基表面暴露在空气中，静态测试时，培养基暴露时间为半小时以上；动态测试时，培养基暴露时间为不大于4h。全部采样结束后，并倒置于3035恒温培养箱中培养48h，取出检查，3个平板上生长的菌落数不得超过1个/皿。浮游菌检测方法及标准：用专门的采样器，宜采用撞击法原理的采样器，一般采用狭缝式采样器、离心式或针孔式采样器，并配有流量计和定时器，严格按仪器说明书的要求操作并定期校验。应注意避免测试仪器对待测试洁净环境的污染，必要时对测试仪器进行表面清洁消毒，或使用无菌的仪器罩。也可在相应的洁净室内准备和存放。使用的培养基为大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或其他用户认可并经验证了的培养基。用于100级洁净室的采样器宜预先放在被测房间内。用消毒剂擦净培养皿的外表面。采样前，先用消毒剂消毒采样器的顶盖、转盘以及罩子内外面，采样结束，再用消毒剂轻轻喷射罩子的内壁和转盘。采样口技采样管，使用前必须高温灭菌。如用消毒剂对采样管的外壁及内壁进行消毒时，应将管中的残留液倒掉并晾干。采样者应穿戴与被测洁净区域相应的工作服，在转盘上放入或调换培养皿前，戴无菌手套操作。采样仪器经消毒后先不放入培养皿，开启浮游菌采样器，使仪器中的残余消毒剂蒸发，时间不少于5min，检查流量并根据采样量调整设定采样时间。关闭浮游菌采样器，放入培养皿，盖上盖子。置采样口于采样点后，开启浮游菌采样器进行采样。100级洁净度的采样体积为1000L，10000剂洁净度采样体积为500L，其余洁净度采集体积为100L。采样点数目可参考悬浮粒子所规定内容，采样点计划参见附录A。全部采样结束后，取出培养皿并将碟盖盖好，倒置于3035恒温培养箱中培养48h，取出检查，用计数方法得出各个培养皿的菌落数，每个测点的结果以浮游菌平均浓度为准。每个测定的浮游菌平均浓度的计算公式为：平均浓度（个/m3）=洁净度为100级区域浮游菌平均浓度应5个/m3，洁净度为10000级区域浮游菌平均浓度应100个/m3，洁净度为100000级区域浮游菌平均浓度应500个/m3。表面接触菌及手套菌采样计划：在每次无菌检查实验过程中，应动态跟踪监测表面接触菌及手套菌，以无菌方式将采样所需数目之大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或其他用户认可并经验证了的培养基平板（或用表面接触性平皿替代）带入洁净室（区），用无菌脱脂棉擦拭实验用器具表面后，将该脱脂棉均匀涂布于采样平板的培养皿表面；实验人员在样品瓶消毒和其他准备工作后，无菌检查关键操作步骤前必须再用消毒剂消毒手套，在无菌检查操作完成时，将双手接触指面涂抹于另一采样平板的培养基表面。将采样平板倒置于3035恒温培养箱中配有48h，取出检查。对上述采集之沉降菌、浮游菌、表面接触菌及手套菌应进行菌种的确认实验，即将平板上的单个菌落划线接种至大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）平板上进行纯培养，挑选培养物的单个纯菌落进行革兰染色和镜检，观察其染色特性及微生物形态学特征。并做生化实验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定该菌种属。相关确认鉴定资料应存档备查，相关菌种应随即保藏。菌株分析及阳性菌操作实验应在专门的阳性实验室进行，阳性实验室应符合国家级生物安全标准。2 仪器及用具2.1 洁净室（区）应准备好盛有消毒用5%甲酚或其他适宜消毒溶液的玻璃缸、乙醇灯、火柴、镊子、75%乙醇棉、碘酒棉及拖鞋等。2.2 恒温培养箱及可调2328的生化培养箱。2.3 离心机、显微镜、蒸汽灭菌器、标准pH比色器（0.02%酚磺酞指示液和溴钾酚蓝指示液）、恒温烤箱。2.4 玻璃器皿试管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管（1、5、10ml）、注射器（2、5、10ml）、双碟等，用玻璃洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次。如使用过程中与细菌接触，应先灭菌倒出内容物后再清洗，晾干。凡无菌操作过程中所用的器皿，都应用牛皮纸包扎严密，灭菌。移液管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞少许原棉，然后放于吸管筒内或牛皮纸袋内，封严，灭菌待用；试管、离心管、三角瓶等在管（瓶）口塞上海棉胶专用塞或纱布棉塞，塞子应塞进管口内2/3处，用牛皮纸将管口（包括塞子）包扎严，灭菌待用；将注射器、针头（9号、11号、12号）配对，检查针头是否畅通后，将注射芯、管和针头分别放在双层纱布（或布）内，包扎严密，置带盖容器（瓷盘或铝制饭盒）内，盖严，用牛皮纸包扎后，灭菌待用。长柄取样匙，放于长的不锈钢长筒内，盖严，干热灭菌待用。手术镊、手术剪洗净、擦干。用双层纱布将1把剪刀与1把镊子间隔包扎在一起，放于带盖的容器（瓷盒或铝制饭盒）内，盖严，用牛皮纸包扎，灭菌（参照附录XV 灭菌法）待用。采用蒸汽灭菌的物品取出时切勿立即置冷处，避免因急速冷却，使灭菌物品内蒸汽冷凝造成负压，易染菌，取出后应置恒温培养箱中烘干，待用。2.5 无菌衣、裤、帽、口罩等洗净晾干，配套，用牛皮纸包严，灭菌待用或用一次性的无菌物品代替。2.6 除菌滤器及滤膜 目前有多种开放式及封闭式滤器；微孔滤膜一般直径50mm、孔径0.45m。购得一批滤器（膜），需进行孔径大小的测试，一般有三种方法，选其中一种方法即可。气泡法 先将滤膜浸入水中，使完全湿润，然后用镊子夹住一片滤膜放于气泡点测定装置或滤膜孔径测定仪上，膜上放一块与滤膜大小相同的尼龙筛网，再加上多孔板，将螺旋固定圈旋紧，在多孔板上加35mm深的水（注意排除气泡）关闭放气阀，启动空压机或氮气瓶阀，使压力缓缓上升，注意观察水面上产生第一个气泡时，记录压力表的压力，气泡点压力不应小于2.2kg/cm2(0.2Mpa)。水流量法 将滤膜装于除菌滤器上，开动真空泵，压力在700mmHg（93kPa）下，抽滤已滤清的水约500ml，计算出每1min的滤速。中国药典对滤膜的滤速未明确规定，而美国药典（XX ）规定在700mmHg（93kPa）压力下，滤过直径47mm；流速5575ml/min。细菌截留实验 常用的细菌为粘质沙雷菌(Serratia marcescens)CMCC(B) 41002，将该菌的新鲜培养物接种于营养肉汤培养基中，取此菌液，按滤膜面积每1cm2不少于1ml加至无菌0.9%氯化钠溶液中，按薄膜过滤法过滤，收集全部滤液接种于营养肉汤培养基中（滤液体积不得大于培养基体积的10%），3035培养2448h，应无菌生长。不符合规定的滤膜不得使用。3 菌种及菌液制备菌种的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代；冷冻干燥的原始菌种开启后转种，为第一代）。原始菌种购得后，应由专人负责，接收菌种时应检查安瓿的数量和菌种的名称及每一支安瓿的完整性。并在相应的菌种接收登记表上记录所有关于菌种的信息。将安瓿存于-20，使用时首先需要复活冻干菌种（按菌种保藏中心提供相关资料操作），一般包括以下步骤：冷冻菌种的复活 清洁安瓿（可用75%的乙醇或碘伏）后，用砂轮在安瓿上部1/3处划痕，用干燥的无菌纱布包裹安瓿，将安瓿掰开，用一无菌吸管吸取适量0.50.8ml的液体培养基（生孢梭菌用液体硫乙醇酸盐培养基；金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌用营养肉汤培养基；白色念珠菌、黑曲霉菌用液体改良马丁培养基）滴加到安瓿中，轻轻旋转安瓿并吹打，使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解，再将安瓿内的菌悬液全部吸出，转移至相应的培养基试管中，根据菌种类型采用适宜的培养条件（细菌培养温度3035，1824h；真菌培养温度2328，35天）下培养，观察培养基是否浑浊，（如不浑浊，细菌应延长培养时间至7天以上，真菌应延长培养时间至14天以上，对于经培养仍未浑浊的培养基管，应按相关规定灭菌后处理）。浑浊说明菌种复活生长，在应用前还应确认菌种的纯度和特性。菌种确认 用无菌接种环取上述培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，挑取单个的纯菌落进行革兰染色和镜检，观察其染色特性及微生物形态学特征。并作生化实验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定该菌种。对已通过确认鉴定后的菌种可以使用或传代保藏。菌种传代保藏方法很多，各实验室可根据情况采用，但无论应用何种方法，都应对采用的方法进行验证，确保在相应保存条件下的菌种不会变异且性能稳定，同时也应兼顾到方法的经济和简便。常用的有甘油冷冻管保藏法、斜面低温保藏法等，此类方法简单易行。甘油冷冻管保藏法 将待保藏菌接种平板或琼脂斜面，适宜温度下培养适宜时间后（细菌2428h，白色念珠菌72h），用无菌接种环轻轻刮取菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使细菌充分扩散到预先装于试管中的无菌蒸馏水中（此步操作亦可用无纤维灭菌拭子替代无菌接种环操作），调整菌液浓度，向已制备好的菌悬液中加入等体积、含20%无菌甘油的TSB，轻轻振摇小管，使内容物充分混合，分装于无菌小管，制备好的甘油保藏管最好在-80（至少在-30以下）贮存。斜面低温保藏法 将待保藏菌接种在适宜的斜面培养基表面，在适宜温度培养适宜时间，待菌生长充分以后，把培养好的新鲜菌种管用牛皮纸包好，转移至4左右冰箱保存，如采用半固体高层培养基穿刺培养，需将菌种保藏管的塞子改换为橡胶塞，则可以保存时间较长。铜绿假单胞菌不宜用本法保存。3.1 菌种（1）金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26003（2）大肠埃希菌(Escherichia coli)CMCC(F)44102（3）铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B) 10104（4）生胞梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B)64941（5）白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001（6）黑曲霉菌(Aspergillus niger)CMCC(F)980033.2 菌液制备制备的菌液，一般当日使用。取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养1824h；白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，2328培养2448h；上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每毫升含菌小于100菌落形成单位（cfu）的菌悬液。将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，2328培养57天，使大量的孢子成熟。加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出胞子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液（亦可采用比浊法）。以上菌液在供试验的同时，金黄色葡萄糖球菌，铜绿假单胞菌，大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌用营养琼脂，白色念球菌和黑曲霉用改良马丁培养基注皿（1ml）或平板涂布（0.1ml），按规定条件培养后，计数。4 培养基4.1 一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，配制培养基时称量要迅速，以免吸潮而影响称量的准确性，同时为避免增加培养基中的金属离子及其他微量化学元素而影响微生物的生长、鉴定。所用器具应为洁净玻璃器皿，所用溶解用水为纯水。4.2 培养基的pH应符合数字规定，否则必需校正。调节pH：测定pH的标准温度为（252），调节pH可用无菌的1mol/L氢氧化钠或10%碳酸钠溶液、1mol/L盐酸溶液或 15%冰醋酸溶液。分装好的培养基及时密封后必须在配制当天（2h内最佳）进行灭菌处理。4.3 新鲜配制的培养基，应按中国药典规定的处方，对培养基的原材料要进行挑选，化学药品均需用CP试剂规格。4.3.1 除葡萄糖和指示液外，将处方中各成分加水后置有石棉网的电炉或适宜的加热设备中，微温溶解。煮沸，用棉（纸）浆减压抽滤或以脱脂棉，滤纸等滤材过滤，使培养基澄清。4.3.2 加入葡萄糖和指示液，摇匀，补足水量，调节pH（比规定的pH略高0.20.4），使灭菌后为7.10.2分装，装量不宜超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。4.3.3 硫乙醇酸盐流体培养基，分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基的氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/5。在供试品接种前，培养基氧化层的颜色不得超过培养基深度的1/3，否则，须经100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却。培养基只限加热一次，并防止被污染。4.3.4 灭菌应采用验证合格的灭菌程序进行。培养基应只能进行一次蒸汽灭菌处理。固体培养基使用前的融化，不宜使用蒸汽灭菌柜进行，宜选用沸水浴融。4.4 未开封脱水培养基应避光储存于25以下阴凉干燥处，已开封的脱水培养基应盖紧，避光储存于25以下阴凉干燥处。制备好的培养基应保存在225避光的环境，有条件置冰箱48冷藏为宜。培养基若保存于非密闭容器中，应在3周内使用；若保存于密闭容器中，可在1年内使用。4.5 培养基的装量4.5.1 对于采用直接接种法检查的液体样品，培养基的装量与供试品装量相关，应根据供试品接种量确定培养基的装量，使供试品接种体积不大于培养基体积的10%。4.5.2 对于采用直接接种法检查的固体样品（含药品及外科用辅料棉花及纱布），培养基的装量均为100ml；对于缝合线、一次性医用材料及医疗器具，如果医疗器具体积过大，培养基的装量可在2000ml以上，以将其完全浸没为准。4.5.3 对于采用薄膜过滤法检查的样品，封闭式薄膜滤器的培养基装量为100ml。4.6 培养基的适用性检查培养基的适用性检查包括无菌性检查和灵敏度检查。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行，符合规定者方可用于供试品的无菌检查。培养基的无菌检查与供试品的无菌检查同时进行，所用培养基不符合无菌要求，则供试品的无菌检查结果应视为无效。培养基的灵敏度检查应对购进的每个批号的脱水培养基进行灵敏度检查，检查合格后方可使用，但当培养基的配制方法和灭菌程序发生变更时，应再次对培养基的灵敏度进行检查。4.6.1 培养基无菌检查的操作及结果判定每批培养基随机取不少于5支（瓶），按规定温度培养14天，应无菌生长。本试验亦可与供试品的无菌检查同时进行。4.6.2 培养基灵敏度检查的操作及结果判定取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，每支接种量为1ml（含菌小于100cfu），另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种白色念珠菌、黑曲霉各2支，每支接种菌量为1ml（含菌小于100cfu），另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。对于配制后的选择性培养基的灵敏度检查试验同上。第二部分 无菌检查方法验证实验5 方法验证实验为保证无菌检验结果的准确可靠，当建立药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的生产工艺，原、辅料组分或检验条件发生改变时，检查方法应进行重新验证。验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作试验。供试品对每一试验菌的抑菌活性应逐一进行验证。验证用菌种、菌液制备、各试验菌所对应的培养基及培养温度参见3.1及3.2部分。5.1 薄膜过滤法验证实验将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入少于100cfu的试验菌，过滤，滤净后每个培养器内灌注100ml培养基；因方法验证实验旨在确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计，故薄膜完整性可保证的情况西安，可在最终培养体系中直接加入小于100cfu的试验菌，避免在洁净实验区操作菌液的风险。取装有同体积培养基的容器加入等量的试验菌，作为阳性对照。含培养基的各试验容器按规定温度培养35天。各试验菌及相应的培养基同法逐一进行验证（以大肠埃希菌代替培养基灵敏度实验中的铜绿假单胞菌，其余同培养基灵敏度实验。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌）。选用薄膜过滤法的供试品，多为具有抗菌活性的液体制剂或可溶性固体制剂，在薄膜过滤前，要根据供试品的抗菌性强弱，选用适宜、适量的溶剂溶解及稀释；冲洗样品时流速不宜过快；每张滤膜每次冲洗量为50100ml，为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液剂冲洗液覆盖整个滤膜表面。相应的溶解、稀释剂冲洗程序一旦验证成立，无菌检查时应严格按照该程序操作。5.2 直接接种法验证实验取适宜装量的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别加入金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌的菌液各2管；取适宜装量的改良马丁培养基4管，分别加入白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各2管。每管加菌量小于100cfu。其中1管接入规定量的供试品，另 1管作为阳性对照，各试验管按规定的温度培养35天。5.3 判断与阳性对照比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，并且与阳性对照容器内的培养结果相似，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或抑菌作用消除，供试品可按该法进行无菌检查法检查。若含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，若采用的是直接接种法，可根据实际情况增加培养基的用量、在冲洗液或培养基中使用中和剂、灭活剂或表面活性剂。若采用的是薄膜过滤法，可采用增加冲洗液的用量、改变冲洗液的种类、更换滤膜材质或在培养基中使用中和剂、灭活剂或表面活性剂等方法消除供试品的抑菌作用。并重新进行验证试验。若需使用中和剂、灭活剂或表面活性剂等，应证明其有效性，且对微生物无毒性。已进行过无菌检查方法验证试验的供试品，按此法进行无菌检查。第三部分 供试品的无菌检查6 供试品的无菌检查6.1 检验数量及检验量检验数量 是指一次试验所用供试品最小包装的数量。除另有规定外，出厂产品按表1规定，应尽量抽取批生产开始和结束或生产过程出现异常情况下的产品进行检验；上市产品监督检验按表2、表3规定。表1、表2、表3 中（见中国药典2010年版附录无菌检查法）最少检验数量不包括阳性对照试验用量。一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤，应增加1/2的最小检验数量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品1支（或瓶）作阳性对照用。检验量 是指一次试验所用的供试品总量（g或ml）。除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表1、表2、表3规定。采用直接接种法时，若每支（瓶）供试晶的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。6.2 培养基用量 除另有规定外，供试品无菌检查时，每支培养基的实际装量及所占容器高度的比例应与“验证试验”所用的培养基相同。6.3 阳性对照供试品无菌检查应进行阳性对照试验。阳性对照菌的选择原则：应根据验证试验结果选择相应对照菌（见中国药典2010年版附录无菌检查法），阳性对照管的加菌量为小于100cfu。阳性对照的供试品用量同供试品无菌检查中每份培养基接种的样品量，阳性对照管培养4872h，应生长良好。6.4 阴性对照凡供试品无菌检查时，应取相应溶剂、稀释、及同批次滤器同法操作作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。6.5 无菌检查操作无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。6.5.1 供试品在移入缓冲间前应除去外包装、消毒外表面并编号，培养基管（瓶）用0.1%新洁尔灭或酒精棉擦拭瓶（管）外壁，然后连同其他用具（包括无菌衣、帽、口罩等）移入缓冲间，开启洁净室（区）紫外灯和空气过滤装置并使其工作1h以上。6.5.2 操作人员用肥皂、水清洗双手，关闭紫外光灯，进入缓冲间，换拖鞋，再用75%乙醇棉球擦手，穿戴衣、帽、口罩及无菌手套。将所需物品剥去牛皮纸，移入洁净操作间，每次试验中所用物品必须计划好，并有备用物。6.5.3 供试品外部消毒6.5.3.1 取西林瓶装粉针剂、油剂等样品瓶，除去铝塑盖及铝制小圆片，用适当消毒液擦拭或浸没消毒外表面后，用75%乙醇棉球擦拭外壁及瓶塞部位，待干，将瓶塞部位过火焰数次。6.5.3.2 取安瓿装注射剂，用适当消毒液擦拭或浸没消毒外表面后，用75%乙醇棉球擦拭外壁，待干，用砂轮或灭菌锉在安瓿颈部划痕（便于折开安瓶），再用75%乙醇棉球将碘酒擦拭划痕处，待干后将安瓿颈部过火焰数次。6.5.3.3 其他供试品容器表面或外包装，可参照上述供试品。6.5.4 供试品制备操作时，按6.5.3对供试品容器表面和取样部位进行彻底消毒。用灭菌镊取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头（或用一次性无菌注射器替代），供试品瓶盖和注射器针头均应迅速通过火焰数次。6.5.4.1 供试品为水溶液供试品，可直接作为供试液备检，或混合后至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，作为供试液备检。6.5.4.2 供试品为可溶于水的固体制剂，可按标签说明复溶后直接作为供试液备检，或者混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，作为供试液备检。6.5.4.3 供试品为非水溶性制剂供试品，可直接作为供试液备检（如油溶液），或混合溶于含适宜表面活性剂的稀释液中，充分混合，作为供试液备检。6.5.4.4 供试品为膏剂和黏性油剂供试品，可取规定量，混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯中，剧烈振摇，使供试品充分溶解，如果需要可适当加热，但温度不得超过44，保温，作为供试液备检。6.5.4.5 供试品为无菌气（喷）雾剂供试品，将备检容器置于至少-20的冰室冷冻约1小时，以无菌方式迅速在容器上端钻一小孔，释放抛射剂后再开启容器，并将供试品转移至无菌容器内，参照6.5.4.1或6.5.4.3的描述操作。6.5.4.6 如供试品容器内有一定的真空度，需加入空气加压后便于抽出时，应用注射器在火焰附近抽取空气注入供试品瓶内，供试品需用灭活剂溶解时，用灭活剂溶解后用适宜溶剂稀释至规定的浓度。6.5.4.7 供试品为注射用无菌原料药，取样时为缩短暴露时间，应由两人操作。将放置于缓冲间的包装瓶用0.1%新洁尔灭抹净外壁，经紫外线照射1小时后移入操作间（台），除去铝盖，用75%乙醇棉球擦拭瓶口橡胶塞外壁和瓶口缝隙，待干，戴好无菌手套，在火焰旁小心揭开瓶塞，用灭菌长柄不锈钢药匙取出取出规定量的样品，置经1/1000天平称定重量的灭菌试管中，密塞待用，立即盖好大包装瓶塞，用橡皮胶布及时封口，再用封箱纸包扎瓶口。如果容器内有一定的真空，可用适当的无菌器材（如一头带有除菌过滤器的针头），向供试品容器内导入无菌空气，再按无菌操作启开容器取出内容物。6.5.4.8 供试品为注射器预充药物的供试品，取规定量，排出注射器中的内容物至无菌容器中，或吸入适宜稀释液或用标签所示的溶剂溶解，然后参照6.5.4.1或6.5.4.3的描述操作。若预充药物的注射器与针头为一体包装，可按如上操作；如预充药物的注射器与针头分别独立包装，针头的无菌检查应符合规定。6.5.4.9 供试品为具有导管的医疗器具（输血、输液袋等），取规定量，每个最小包装用50100ml冲洗液分别冲洗内壁，收集冲洗液于无菌容器中，参照6.5.4.1描述操作。供试品处理时所用的溶剂、乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应证明是有效的，并对微生物无毒性。除另有规定外，供试品处理及接种，按下列方法进行。6.5.5 薄膜过滤法薄膜过滤法应优先选用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45m，直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。抗生素供试品应选择低吸附性的滤器及滤膜。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液剂冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为50ml或100ml，且总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。6.5.5.1 操作取出无菌检查用集菌培养器，检查包装是否完好无损，将培养器逐一插放在滤液槽座上，将其塑胶软管装入集菌仪的蠕动泵的管槽内，注意定位准确，软管走势顺畅。其进液软管的双芯针头插入供试液容器的塞上，开启集菌仪，将供试液容器倒置，使药液均匀通过滤器，待药液滤净后，关闭电源，将双芯针头取下，插至装有适宜冲洗液容器的塞上，冲洗培养器滤膜，按照经验证的冲洗次数及冲洗量试验（经验证无抑菌作用的供试品，薄膜过滤后，无需冲洗）。滤干后关闭电源。将培养器顶部排气孔处的胶帽取下，套住底部排液管口，将进液软管的双芯针头插至相应培养基容器的塞上，开启蠕动泵，将培养基导入指定的培养器，关闭电源。用塑料卡卡住于培养器连接处的进液软管，在进液软管剪切线的位置剪断软管，将软管开口端套在培养器顶部的排气孔处。置适宜温度培养14日。每次操作时，均应取相应溶剂和稀释剂、及冲洗液同法操作，作为阴性对照。将已操作完毕的含培养基的集菌培养器转移出洁净操作间，取其中一管作为阳性对照，6.3阳性对照操作。6.5.6 直接接种法对于经多种方法前处理后仍无法采用薄膜过滤法的供试品，可采用直接接种法，即取规定量的供试品分别接种至含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。若供试品具有轻微抑菌作用，可加入适量的无菌中和剂或灭活剂，或加大每个容器的培养基用量。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法验证实验。操作 在火焰附近以无菌操作用适宜的灭菌用具，直接吸取规定量的供试品（或取以适宜方法制备的供试液管，在近火焰处，握拳以小指夹住培养基管的塞子，拔开塞子，培养基管口通过火焰，在火焰附件以无菌操作吸取规定量供试液）沿着培养基管壁分别接种于硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，各管接种后轻轻摇动，置适宜温度培养14日，另接种一管硫乙醇酸盐流体培养基操作结束后移至阳性菌室接种金黄色葡萄球菌阳性对照菌液1ml（含菌小于100cfu）作为阳性对照。每次操作时，均应用同批灭菌器具抽取培养基，或吸取相应溶剂、稀释剂同法操作，作为阴性对照。第四部分 结果判断及确证7 结果判断7.1 培养及观察培养期间应逐日观察培养器并记录是否有菌生长、填写检查记录表。若供试品管在检查时限内均澄清，或虽浑浊但经确证并无微生物生长，则判断供试品符合规定。如在加入供试品后或在培养基培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取原培养液涂片、镜检，判断是否有菌。如果复接种后的培养基再次出现浑浊；或镜检结果有菌，均应定义为疑似阳性培养物，应对疑似阳性培养物进行进一步的微生物学检测。必要时，在供试品培养基出现浑浊时，即可以无菌操作取少许浑浊培养液涂片，染色，镜检，进行判断或以无菌操作取出浑浊内容物少许，接种至相同体积和种类的培养基中，置于相同培养条件下继续培养，如上操作。若继续培养浑浊物没有出现扩增，或是将浑浊物复接种后培养基未出现再次浑浊，且该浑浊物经确认并非微生物，则判断供试品符合规定。7.2 疑似阳性培养物的微生物学检测将复接种后再次出现的疑似阳性培养物，划线接种至大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或其他微生物鉴定用培养基表面，置相应温度培养1824h或直至培养基表面有菌落形成。观察并记录其菌落形态，挑取单个纯菌落进行革兰染色和镜检，观察并记录其染色特性及微生物形态学特征。并作生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定该菌种。对已通过确认鉴定后的微生物予以保藏，保藏方法参考甘油冷冻管保藏法。7.3 疑似阳性培养物的溯源性检测将疑似阳性培养物的菌落形态、革兰染色结果、镜检结果、生活试验结果及菌种鉴定结果与洁净室（区）采集的浮游菌、沉降菌、表面接触菌及手套菌的相应结果比对（或用其他分析手段，如微生物红外分析系统或分子生物学技术分析浑浊物与洁净区采集微生物的同源性），若浑浊物的以上结果与洁净室（区）内采集的微生物结果高度一致，则判为同源，表明该疑似阳性培养物来自洁净操作区或由于实验人员操作不当导致的污染，则该实验结果应判为无效。若比对结果显示同源性较低，则需进一步回顾无菌实验过程。7.4 结果判断供试品管培养基在规定时限内出现的浑浊，需经如上操作确认浑浊物来源，除非能充分证明实验结果无效，即生长的微生物非来源于供试品，否则将判供试品不符合规定。当符合下列至少一个条件时，方可判断实验结果无效：（1）无菌检查实验所用的设备及洁净环境微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。（2）回顾无菌实验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。（3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌实验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。第五部分 无菌检查法附录附录A洁净室（区）采样点布置A1 洁净室（区）采样点布置宜力求均匀，避免采样点在局部区域过于稀疏。下列采样点的图示可作参考。水平单向流区域，洁净工作台或局部空气净化设施的采样点布置可参考以下图示：水平单向流垂直单向流采样点一般在工作面上0.2m高度的平面上均匀布置。附录B培养基及其制备方法培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在225、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，应在三周内使用；若保存于密闭容器中，可在一年内使用。1. 硫乙醇酸盐流体培养基（用