(一)同等学力研究生答辩手册1.doc

硕士学位论文（专业型学位） 雌三醇及拮抗剂三苯氧胺对兔耳瘢痕增生影响的实验研究专业： 整形外科 姓名： 窦孝康 导师： 程代薇 教 授 2013年 5 月中图法分类号_R735.4_密级_硕 士 学 位 论 文雌三醇及拮抗剂三苯氧胺对兔耳瘢痕增生影响的实验研究 窦孝康 指导教师 _ 程代薇 _申请学位类别_ 专业型学位 _学科门类_ 医学_ _ _专业名称_ 整形外科 _研究方向 创伤修复论文提交日期_2013_年_5_月_6_日论文答辩日期_2013_年_5_月_13_日2013年 5 月 13 日遵义医学院硕士研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。学位论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日遵义医学院学位论文版权使用授权书本人完全了解遵义医学院有关保留、使用学位论文的规定，即：遵义医学院有权保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权遵义医学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存学位论文，即：遵义医学院具有学位论文的数字化制品复制权，信息网络传播权和汇编权。保密的学位论文在解密后适用本授权书。学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日英文缩略词表缩略词bFGFBMPECMEGFFGFFnHAIGFIL-1KFBMMPmTORPBSPDGFTH-1TH-2TGFTGF-1TNFTNF-VEGF英文全称basic fibroblast growth factor Bone Morphogenetic Protein Extracellular matrix Epidermal Growth Factor fibroblast growth factor fibrin Hyaluronidaseinsulin-like growth factor interleukin-1 keloid derived fibroblast matrix metalloproteinaseThe mammalian target of rapamycinPhosphate Buffered Saline platelet-derived growth factor T helper lymphocytes-1T helper lymphocytes-2transforming growth factor transforming growth factor -1 tumor necrosis factor tumor necrosis factor-Vascular Endothelial Growth Factor 中文全称碱性纤维母细胞生长因子骨形态发生蛋白细胞外基质表皮生长因子成纤维细胞生长因子纤维蛋白透明质酸酶胰岛素样生长因子白细胞介素-1瘢痕成纤维细胞金属蛋白酶哺乳动物雷帕霉素靶蛋白磷酸盐缓冲盐水血小板衍生生长因子辅助性T淋巴细胞-1辅助性T淋巴细胞-2转化生长因子转化生长因子-1肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子-血管内皮生长因子目 录（四号宋体）论文：雌三醇及拮抗剂三苯氧胺对兔耳瘢痕增生影响的实验研究1英汉缩略词对照表中文摘要英文摘要前言材料与方法结果讨论结论参考文献2、综述：雷公藤多甙的研究进展3、致谢4、 作者简介雌三醇及拮抗剂三苯氧胺对兔耳瘢痕增生影响的实验研究中文摘要目的：探讨雌三醇乳膏对兔耳瘢痕的影响及三苯氧胺的拮抗作用。方法：采用新西兰大耳兔24只，体重为2.2-2.8kg,兔龄在3-4月，均为雌性，分笼人工饲料喂养，随机分成三组，第一组为雌三醇实验组（简称雌三醇组），第二组为三苯氧胺拮抗组（简称三苯氧胺组），第三组为空白对照组（简称对照组）。每只兔分别在左右耳腹面上制造六个直径为1.2的园形创面：去除皮肤及皮下组织，直至软骨膜层。术后2周起，雌三醇组以雌三醇乳膏外涂创面，0.01g/每创面，每日一次；三苯氧胺组除用雌三醇乳膏外涂外加用三苯氧胺喂服，10mg/日；对照组创面不用药物。每周观察一次兔耳瘢痕：包括瘢痕硬度、色泽、厚度皮钉大小、数目情况，在术后2周（用药前）及术后5周分别切取三组瘢痕作HE染色及免疫组化，观察瘢痕中成纤维细胞情况及transforming growth factor -1 （TGF-1）的表达情况。结果：术后两周，三组兔子在打孔处均有增生样瘢痕出现，在未用药之前，三组瘢痕的大体表现出轻度增厚、变硬，但组间无明显区别，且免疫组化中的TGF-1的表达情况亦无明显统计学差异。使用雌三醇以及三苯氧胺后，第一组瘢痕增生明显，表现表面凹凸不平、质地硬、色泽偏暗红、厚度增加并有大量皮钉形成，而第二组瘢痕明显扁平。表现表面光滑、质地软、色泽接近正常、厚度变薄，较少皮钉形成，第三组在外观上与三苯氧胺相比，仅皮钉数目多于三苯氧胺组。用免疫组织化学方法检测见雌三醇组瘢痕中TGF-1表达明显高于三苯氧胺组，差异具有统计学意义。而对照组的TGF-1表达高于三苯氧胺组，差异亦具有统计学意义。结论：雌三醇乳膏对兔耳瘢痕有促进增生的作用，并与TGF-1表达情况同步。，三苯氧胺可以抑制雌三醇导致的兔耳瘢痕增生。关键词： 雌三醇 三苯氧胺 增生瘢痕 transforming growth factor -1 （TGF-1）Experimental study the influence of Estriol ointments and antagonist Tamoxifen on scar in rabbit earsAbstractObjective: To investigate the effect of Estriol and antagonist Tamoxifen on rabbit ears scar.Methods : Adopt twenty four The New Zealand rabbits as a specimen, their weight is 2.2-2.8kg, the age between 2-4m, all of the rabbits were female and artificial feeding. They were randomly divided into three groups, the first group is Estriol ointments group(Estriol group), the second group is Tamoxifen group(Estriol group), The third group is the blank control group (control group).In the right ventral side of rabbit ears, punch six 1.2 cm circular holes in it, then remove the skin and subcutaneous tissue until the cartilage layer. After two weeks, each group appears scar. In the first group are applied with Estriol ointments(0.01g/ each wound); The second groups fed with Tamoxifen(10mg/each day) tablet and coated with Estriol ointments. Another two weeks, The change were observed in rabbit scars, including texture , thickness and hardness. the TGF 1 in rabbit ears are measured by immunohistochemical staining.Results: Two weeks later, Hypertrophic scars appear in each circular hole. Before using medicine, three groups of Hypertrophic scars generally has no obvious change, the content of TGF 1 rabbit ears are showed no significant statistical difference, Through using medicine affect Hypertrophic scars of rabbit ears，the first group of specimen shows uneven surface, hard texture, color， thickness and a large number of nail scar, while the second group main express smooth surface, soft texture, normal skin color, flimsy, and less nail scar are formated. The third group compared with Tamoxifen group in appearance, only nail scar more than tamoxifen group. Immunohistochemistry was used to detect,the research shows that Estriol group in the scar tissue expression of TGF- 1 was significantly higher than that in the Tamoxifen group, the difference was statistically significant difference. While the control group of the expression of TGF- 1 higher than Tamoxifen group, the difference has statistical significance. Conclusion: The results show that Estriol ointments can promote the proliferation of Hypertrophic scars of rabbit ears, from the point of view of biochemistry, Estriol ointments promote the proliferation of Hypertrophic scars of rabbit ears by the TGF 1 pathway, however ,Tamoxifen can inhibit the proliferation of Hypertrophic scars of rabbit ears.Key Words: Estriol ointments Tamoxifen Hypertrophic scars TGF-1前 言瘢痕是物理、生物、化学等因素的损害作用于人体皮肤软组织，导致皮肤软组织的损伤而不能完全自行正常修复，转由纤维组织替代修复遗留的病理状态。瘢痕防治是医学美容临床中常见的热门课题，人的一生中都会经历各种形式的创伤，创伤的修复最终都表现为瘢痕愈合，瘢痕的增生及演变情况可能会明显影响美观，并会导致功能障碍。适度的瘢痕形成是一种生理性和自卫性表现，而过度增生则属于病理性改变。各种原因引起的创伤都需要依靠瘢痕组织的生成，使创口相互连接，创面的愈合包括三个步骤(1)肉芽组织形成将创腔填满，创面铺垫平整。(2)创缘的向心性收缩，牵拉四周正常皮肤向内移动使边缘互相接近。(3)上皮再生，源于创面的皮肤表皮的新生上皮细胞向创面中心聚拢推进，逐渐覆盖肉芽组织，形成皮肤瘢痕，创面最终愈合。瘢痕从病理学角度可分三类（1）正常皮肤瘢痕；（2）增生性瘢痕；（3）瘢痕疙瘩。其中增生性瘢痕和瘢痕疙瘩属于病理性增生，这种病理性瘢痕发生的机制至今还不很清楚，因此治疗难以取得突破。目前针对瘢痕的治疗方法较多，包括加压治疗、药物治疗、放射治疗、激光治疗、冷冻治疗、中医药治疗以及手术治疗等。但是没有一种方法能理想地去除瘢痕。近年来对瘢痕的基础研究取得了一些成就，发病机制有一些新的认识，尤其是在细胞生物学和分子生物学水平方面，各种与瘢痕相关因子及信号传导通路纷纷被认识，为瘢痕的有效治疗带来新的希望。在这些研究当中，生长因子的研究无疑是现今的热点， 在众多的细胞因子中，TGF无疑是研究的热点之一，TGF与瘢痕增生有密切的关系，围绕TGF相关的通路及药物研究也一直引人注目。本研究利用兔耳瘢痕模型 ，采用雌三醇作为瘢痕增生的促进剂并以三苯氧胺作为拮抗剂，通过大体标本的观察、HE染色及免疫组化方法，观察其对兔耳瘢痕模型的影响，揭示雌三醇与瘢痕增生、三苯氧胺抑制瘢痕增生的关系，以及与TGF-1表达的关系。1 材料与方法1.1 主要实验材料模型制作及给药1.1.1 瘢痕模型制作 采用新西兰大耳兔24只，体重为2.2-2.8kg,兔龄在2-4月，均为雌性，分笼人工饲料饲养，随机分成三组，第一组为雌三醇实验组（简称雌三醇组），第二组为三苯氧胺拮抗组（简称三苯氧胺组），第三组为空白对照组（简称对照组）。在每只兔子的左右耳廓内侧分别对称地作六个1.2cm园形标记，剃去表面毛发，以75%酒精消毒，经兔耳缘静脉注射1%的戊巴比妥钠麻醉，麻醉成功后避开双耳腹侧大血管1，用手术刀制作直径约1.2cm园形创面，切取该处标记的皮肤及皮下组织直至软骨层，用克氏针烧灼止血，显露创面，待其自然愈合。每只兔耳制作六个，间隔约1cm。24只兔子共制作288个创面。将每只兔左耳外侧近耳尖部切取的皮肤组织以10%甲醛固定待检。2周后，所有创面均愈合，上皮化完成，兔耳打孔处出现了圆形瘢痕，288处创面均出现瘢痕，无流脓流液。见图1、图2。 图1 在兔耳腹侧制作6个直径约1.2cm皮 图2 模型制作后2周，有淡红色、微突起、肤缺损 质较硬的瘢痕形成。1.1.2 实验组用雌三醇乳膏（默沙东制药有限公司生产 15/支）外涂。涂抹剂量为每孔为0.0015，每日一次；三苯氧胺组除用以同样剂量雌三醇乳膏外涂外加用三苯氧胺（10mg/日）喂服；对照组未用药。每周分别观察兔耳瘢痕大体变化，包括瘢痕色泽、厚度、硬度、直径以及是否有皮钉，并记录。术后5周同上麻醉三组兔子，切取右耳按上述方法切取96处瘢痕组织，用4%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，留待病理切片HE染色及免疫组化检测TGF-1的表达情况。1.2 主要实验仪器与器械脱水机 (Leica ASP300S,Germany)包埋机 (Leica EG1150H,Germany)石蜡切片机 (Leica RM2235,Germany)光学显微镜 （Olympus, JPN）组织切片超纯水制备系统 （Heal-Force NW-VF1 上海力康）电热恒温培养箱 （420-BS 上海跃进医疗器械厂）1.3 主要试剂：本实验所用主要试剂见表1。表1 主要试剂试剂名称 生产厂家 （产地，国别）用途二甲苯 95%酒精 多聚甲醛 无水酒精 PBS 柠檬酸缓冲液 一抗 SP系列检测免疫组化试剂盒品誉化工 （重庆，中国）精工酒精厂（重庆，中国）海川化工 （佛山，中国）海川化工 （佛山，中国）中杉金桥 （北京，中国）中杉金桥 （北京，中国）上海江莱 （上海，中国）上海江莱 （上海，中国） 切片脱蜡脱水细胞固定细胞固定冲洗冲洗免疫组化免疫组化1.4 主要试剂配制柠檬酸缓冲液: 柠檬酸盐一袋，加蒸馏水至2000ml，充分溶解，调至pH至6.0后置4冰箱保存。PBS(g/l): PBS一袋，加蒸馏水至2000ml，充分溶解，调至pH至7.27.4,分装，后置4冰箱保存。1.3 检测方法1.3.1标本切片将上述切取的标本送至我院病理科，将标本脱水制成石蜡标本，然后把该标本用切片机切至3m 厚，移入48恒温热水器中，待缓缓完全展开后贴附于防脱玻片上，60烤箱2小时烘烤后常温冷却，放入4冰箱保存备用。1.3.2 石蜡标本处理（1）标本切片，65温箱烤片2小时至过夜。（2）二甲苯脱蜡5分钟。（3）二甲苯脱蜡5分钟。（4）95%乙醇脱二甲苯1分钟。（5）95%乙醇脱二甲苯1分钟。（6）蒸馏水冲洗1分钟,组织不需要修复。（7）3%双氧水孵育10分钟。（8）蒸馏水冲洗2分钟，PBS浸泡10分钟。（9）滴加一抗工作液(1：2000)，湿盒中孵育4过夜。（10）PBS冲洗，3分钟3次。（11）根据一抗选加二抗（SP0023生物素标记山羊抗兔IgG）。（12）PBS冲洗，3分钟3次。（13）滴加预备好的DAB工作液显色，显色时间为10-20分钟，可在显微镜下观察显色情况。（14）自来水冲洗切片5分钟。（15）苏林素进行复染5秒-1分钟，0.1%盐酸酒精分化（如需要），自来水返蓝。（16）95%乙醇水1分钟。（17）无水乙醇脱水1分钟。（18）水杨酸甲脂透明1分钟。（19）二甲苯透明1分钟。（20）二甲苯透明1分钟。（21）吹干中性快干胶封片。1.4 实验指标采集1.41 大体标本中瘢痕形态： 观察并拍照对比实验组和对照组瘢痕的表面、质地、厚度、色泽、是否有皮钉存在。1.42 瘢痕指数的测定：将HE染色石蜡切片放置于染色光镜下，在100倍光镜镜下用计算机图像分析系统分别测量创面上皮化后的真皮厚度和邻近正常组织的真皮厚度，计算出瘢痕指数，按照下列公式2。1.43免疫组化结果分析：免疫组织化学染色瘢痕组织中含大量TGF-1在成纤维细胞在细胞质或细胞膜呈现棕黄色或红褐色为阳性表达。采用体视学方法对免疫组化结果进行定量分析，利用我院功能病理图像采集仪，400倍光镜下观察，选取阳性细胞表达最高的5个视野，统计阳性细胞数在整个视野中比例，取平均值。计算TGF-1抗原阳性细胞数表达率，10%为高表达,定为阳性。1.5 统计方法采用SPSS17.0软件包分析的处理数据,计量资料采用XS表达，其中每两组样本均数比较采用配对t检验，计数资料采用X 2 检验，以P0.01为差异性统计学意义。 2结果21 大体标本中呈现的瘢痕增生情况：雌激素组可见瘢痕明显高出于皮肤表面，增生比较明显，表现为质地较硬，色泽偏红，中央区出现较大皮钉，而三苯氧胺组瘢痕与皮肤表面相平，增生不明显，表现为质地软，色泽偏暗，中央区未见明显皮钉改变，对照组瘢痕与三苯氧胺组类似，见图3-图5。瘢痕大体表现数据统计见表1： 图3 雌三醇组5周瘢痕增生情况：瘢痕明 图4 三苯氧胺组5周瘢痕增生情况：瘢痕显高出于皮肤表面，质地较硬，色泽偏红， 较平，质地软于雌三醇组，色泽淡，皮钉较中央区有较大皮钉 小而少图5 对照组组5周瘢痕平，质软，色泽淡，皮钉较小而少表1： 瘢痕大体表现统计表雌激素组 三苯氧胺组 对照组 表面 凹凸不平 光滑 光滑 质地 硬 软 软色泽 暗红 接近正常 接近 正常厚度（） 0.5-0.7（平均0.56） 0.2-0.5（平均0.34） 0.3-0.5（平均0.36）直径（） 1.0-1.2（平均1.12） 0.9-1.0（平均0.95） 0.9-1.1（平均0.94）皮钉（个） 90 24 592.2瘢痕指数的测定：雌激素组瘢痕明显高过周围皮肤表面，测量的瘢痕指数为2.250.34；而三苯氧胺组瘢痕则较为扁平，测量的瘢痕指数为1.640.25，而空白对照组瘢痕也呈现为扁平瘢痕表现，测量的瘢痕指数为1.090.18，通过雌激素组与空白对照组以及三苯氧胺组与空白对照组配对比较，采用t检验，结果显示雌激素组与空白对照组相比P0.01，有差异性统计学意义。三苯氧胺与空白对照组比较P0.01,亦具有差异统计学意义。2.3瘢痕组织光镜下HE染色及免疫组化检测结果：2.3.1光镜检查结果：雌激素组发现瘢痕组织中胶原纤维增多，排列杂乱，血管数目增多，成纤维细胞大量增多，淋巴细胞、浆细胞以及中性白细胞增多，见图6a。三苯氧胺组瘢痕组织中胶原纤维减少，成纤维细胞较少，血管数目少，排列整齐，淋巴细胞、浆细胞以及中性白细胞减少，见图6b。对照组介于两者之间见6c。 图6a 雌三醇组（HE 100） 图6b 三苯氧胺组（HE 100）图6c 对照组（HE 100） 2.3.2 免疫组化检测结果：TGF-1主要在成纤维细胞细胞质中表达，雌激素组TGF-1在兔耳瘢痕中呈高表达反应，见图7a，而三苯氧胺组及对照组均呈低表达反应，见图7b-图7c。 图6a：雌三醇组TGF-1呈密集、色深表达 图6b：三苯氧胺组TGF-1表达明显减少图6c：对照组TGF-1表达情况 2.3.3 免疫组化检测兔耳瘢痕组织中TGF-1抗原阳性表达例数与临床参数关系，见表2：表2 免疫组化检测兔耳瘢痕组织中TGF-1抗原阳性参数组别 NN （）% X 2 P 雌激素组 96 空白对照组 96三苯氧胺组 9690 93.75 28.8059 61.46 24 25.00 26.00 0.01 0.01 3.讨论 当机体组织特别是皮肤组织受到一定强度的创伤后，机体首先出现炎症反应，在受伤部位发生粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞浸润，释放出大量的炎症介质和生长因子。随后成纤维细胞和肌成纤维细胞大量增生并合成的胶原和基质，愈合后形成瘢痕。适度的瘢痕形成是一种机体生理性和自卫性表现，而过度增生则属于病理性改变。增生性瘢痕是病理性瘢痕中的一种，是皮肤受到损伤后出现成纤维细胞过度增殖、胶原蛋白、纤维蛋白、氨基多聚糖等细胞外基质过度沉积所致3。研究表明，创伤后炎症反应释放的细胞因子，如FGF 、TGF-、 TGF- 、PDGF、 IL-1 、TNF-及IGF,这些因子可以促进创面愈合，但同时这些因子又是促进成纤维细胞的过度增殖和胶原纤维大量合成4的因素。然而，细胞因子受何种因素影响、细胞因子通过何种通路调控成纤维细胞行为、如何影响瘢痕形成与发展一直是人们关注的焦点。雌激素属脂溶性激素，可以透过细胞膜，经细胞质、再经过核膜而进入核内，以核蛋白作为受体，直接在染色质上改变受体的构象而发挥作用8。雌激素对子宫内膜和平滑肌的代谢有明显促进作用。刺激阴道上皮基底层细胞增生、分化、成熟以及角化和引起核致密变化及刺激人类乳腺导管的生长和乳腺腺泡的发育。从上述我们不难看出，雌激素生物学活性主要表现为促进作用，既往的研究也证实雌激素能促进创面愈合。但其对瘢痕增生的作用尚未见报道。在本次的研究中，雌三醇表现为可促进瘢痕增生，且此作用可被三苯氧胺所阻断。三苯氧胺结构与雌激素相似，为雌激素受体竞争性抑制剂。存在Z型和E型两个异构体，Z型具有抗雌激素作用，Z型异构体进入细胞内能与雌激素受体结合成受体复合物，从而使雌激素不能再入靶细胞，从而阻止雌激素发挥作用。本次实验中，在兔耳创面瘢痕上局部使用雌三醇可导致瘢痕增厚、成纤维细胞及微血管增多，而使用三苯氧胺拮抗后此增生可得到抑制瘢痕。这与李兵、仇树林9等报告的三苯氧胺可以抑制增生性瘢痕成纤维细胞增生结论相吻合。在哺乳动物的机体有多种细胞均可分泌非活性状态的TGF-，非活性状态的TGF-通过酸化可被活化。在哺乳动物体内发现了3种亚型，分别为TGF-1、TGF-2、TGF-3，而TGF-1、TGF-2与瘢痕增生有密切关系10-11。TGF-1能够加速成纤维细胞增殖，刺激胶原等胞外基质的沉积，趋化巨噬细胞向伤口聚集，诱导肉芽组织的生长，在促进创面修复以及修复后组织的改建过程中起重要作用。从免疫组化结果可见：TGF-1在雌三醇组的表达明显高于三苯氧胺组及对照组。在成纤维细胞的细胞质中呈现为多量、片状棕黄色。说明雌激素导致的瘢痕增生亦与TGF-1有关。在增生性瘢痕和正常皮肤组织中均有阳性表达，且呈现的是弱阳性表达,其结果主要表现在细胞质呈现黄色或棕黄色颗粒。三苯氧胺组中由于三苯氧胺可以拮抗雌激素的作用，在瘢痕组织中，TGF-1表达呈现的是低表达反应，仅有散在的黄色或棕黄色的成纤维细胞存在。说明瘢痕的增生和TGF有明显相关性，这与赵京玉、柴家科等7报道的他莫西芬软膏对兔耳增生性瘢痕中TGF-2表达的情况相符。但是此次试验性研究我们只将瘢痕中的细胞因子TGF-1纳入研究，随着以后研究的深入，会有更多的细胞因子被发现，也会揭示出更多雌激素引起瘢痕增生的原因。增生瘢痕的模型制作对于研究瘢痕形成、发展有重要意义，虽已有许多研究，但目前仍以兔耳瘢痕模型为佳，本实验可见局部使用雌三醇乳膏可导致明显的增生结果。因此，是否可将在局部使用雌激素作为制作增生性瘢痕模型的方法是值得研究的。鉴于本实验例数少、时间短，检测指标比较简单，尚不能下定论，但可作为有价值的参考。4.结论：雌三醇乳膏对兔耳瘢痕有促进增生的作用，并与TGF-1表达情况同步。三苯氧胺可以抑制雌三醇导致的兔耳瘢痕增生。实验结果还对增生性瘢痕的模型制作有参考价值。参考文献1李荟元，刘建波，兰海.建立增生性瘢痕动物实验模型J. 第四军医大学学报 1998,19(6):655-6562陈煜华，鲁开化，刁建升，等.靶向沉默血管内皮生长因子对兔耳增生性瘢痕的影响中国美容整形外科杂志J. 2013,24:（3） 144-145.3Arakawa M,Haamochi A,MORI Y et al.Reduced collagenase gene expression in fibroblasts from hypertrophic scar tissueJ.Br J Dermatol,1996;134(5):863-8684CARVALHO.PDE T,SILVA IS,REIS F A.,et al.Influence of ingaalp laser (660nm) on the healing of skin wounds in diabeticratsJ.Acta nciaJ. 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