瓜蒌皮体外抗氧化作用研究.docx

瓜蒌皮黄酮类化合物体外抗氧化作用研究氧化也称氧化作用或者氧化反应,是指有机物在反应体系中引入氧或脱去氢的作用。氧化作用与人体的很多症状紧密相关,如:衰老、心血管疾病等。而氧化作用的发生,很多是由于自由基的存在而造成的。人体内的自由基可分为:氧自由基和非氧自由基氧自由基占主导地位,大约占自由基总量的95%,包括超氧阴离子(02-)、轻自由基(OH-)、过氧化氢分子(H2O2)、氢过氧基(H02-)、烷氧基(RO)、烷过氧基(ROO)、氮氧自由基(NO)、过氧亚硝酸盐(ONOO-)、氢过氧化物(R00H)以及单线态氧(102)等,它们又统称为活性氧(reactive oxygen speeies,1ROS),都是人体内最重要的自由基;非氧自由基主要包括氢自由基(H)和有机自由基(R)等。因为自由基中存在孤对电子或不平衡电子,所以它们是极不稳定分子或原子。一般,活性氧往往产生于机体内的自然代谢或者机体外部化学物质的作用。活性氧可以通过链式反应攻击细胞内或者体液中的生物分子,如:蛋白质、DNA、脂质等,从而导致各种相关疾病的发生。本实验将就瓜蒌皮总黄酮提取物的体外抗氧化性能进行系统研究,为瓜蒌皮进一步开发利用奠定科学理论基础。1材料与方法1.1材料与试剂瓜蒌皮乙醇提取物无水乙醇、抗坏血酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚、水杨酸、过氧化氢、硫代巴比妥酸、三轻基氨基甲烷(Tris),(分析纯)国药集团化学试剂有限公司铁氰化钾 三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁(分析纯)沈阳沈一精细化学品有限公司、盐酸(分析纯)沈阳化学试剂厂 1,1-二苯基-2-苦基苯胁 sigma公司 ，卵磷脂 北京奥博星生物技术有限责任公司1.2主要仪器设备紫外可见分光光度计1.3试验方法1.3.1清除DPPH自由基的测定精确称取DPPH 9.7mg,加入少量无水乙醇溶解后,以体积分数为95%的乙醇溶液定容至250mL,制成浓度为0.2mmol/L的DPPH溶液取2mL已配制的DPPH溶液,分别加入1mL不同浓度的瓜蒌皮黄酮提取液,以95%乙醇补足到4mL,混匀,放置30min后,在517nm处测定样品吸光值As:,以95%乙醇为空白对照,测定Ac(李春阳,2006).以蒸馏水作参比,Vc为阳性对照,按下式计算清除率及IC50清除率/%=(Ac-As)/Acx100式中:Ac一空白的吸光度As:一样品的吸光度以样品浓度与清除率作图,根据拟合方程求出清除率为50%时所需样品的浓度,即半数抑制浓度IC5o.1.3.2抗脂质体过氧化能力的测定1.3.2.1试剂的配制1、脂质体PBS分散系(LLs):3oomg卵磷脂溶解于3omL 10mmol/LpH7.4PBS(磷酸缓冲液),冰浴震荡(李颖畅,2008;莫开菊等,2006)。2、三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HCL)混合液:15gTCA,0.37gTBA,2.lmL浓盐酸依序放入1OOmL水中(李颖畅,2008;莫开菊等,2006)。1.3.2.2测定步骤分别于样品管中依次加入1mL卵磷脂溶液 (LLS)、lmL0.4mmol/L硫酸亚铁、1mL样品,混匀，避光,于37水浴60min,加入2mLTCA-TBA-HCl混合液,90-100水浴15min,迅速冷却,以30O0r/min离心10min,取上清液在535nm测定吸光度As。空白管以1mL重蒸水代替1mL样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度Ac。参比管中以1mL重蒸水代替1mL卵磷脂,Vc为阳性对照(李颖畅,2008;莫开菊等,2006;张尔贤等,1996)。按下式计算清除率及IC50。清除率/%=(Ac-As)/Acx100IC50的计算同1.3.1。1.3.3还原力的测定取不同浓度的瓜蒌皮黄酮提取液1mL于试管中,依次加入2.5mL O.2mol/L磷酸缓冲液(pH=6.6)和2.5mL质量分数l%K3Fe(CN)6混匀,于55恒温水浴中温育2Omin后,迅速冷却,加入2.5mL质量分数10%的三氯乙酸混合后,以300Or/min离心1Omin,取上清液2.5mL,依次加入2mL蒸馏水和O.5mL质量分数0.1%的FeC13溶液,充分混合,静置10min后,于700nm处测定样品吸光度值As:,吸光度越大,表示还原能力越强。空白管以1mL重蒸水代替1mL样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度Ac。用蒸馏水作参比,Ve为阳性对照(陈留勇等,2004)。还原力=As-Ac1.3.4清除超氧阴离子自由基(02-)的测定取4.5mLpH8.2的50mmol/L Tris-Hcl缓冲液,4.2mL蒸馏水,混匀,于25恒温水浴中保温2Omin,取出后立即加入在25预热过的25mmol/L邻苯三酚溶液0.4mL(以10mmol/LHCl配制,空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚的HCI溶液),迅速摇匀后于25恒温水浴中反应5min,加入8mmol/L HCl 1mL终止反应,于320nm处测定样品吸光度As。空白管以1mL重蒸水代替1mL样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度汉Ac(Yen G.C,ChenH.Y.,1995)。以蒸馏水作参比,Vc为阳性对照。按下式计算清除率及IC50。清除率/%=(Ac-As)/Aex100IC50的计算同1.3.1。1.3.5清除轻基自由基(.OH)的测定利用H2O2与Fe2+反应产生OH，在体系内加入水杨酸捕捉并产生有色物质,该物质在510nm下有最大吸收。反应体系中含8.8mmol/L H2O2lmL,10mmol/LFeso4lmL,1Ommol/L水杨酸-乙醇1mL ,分别加入不同浓度瓜蒌皮黄酮提取液1mL,最后加H2O2启动反应,37反应0.5h,在510nm下测定样品吸光度As。空白管以1mL重蒸水代替1mL样品,操作方法同样品管,可测得空白管的吸光度Ac(牛桂玲等,2009)。以蒸馏水作参比,Vc为阳性对照。按下式计算清除率及IC50。清除率/%二(Ac-As)/Acx100IC50的计算同1.3.1。1.4数据分析采用DPS统计软件进行方差分析2结果与分析2.瓜蒌皮黄酮清除DPPH自由基能力试验结果见图1和图2。如图1和图2所示,瓜蒌皮黄酮对DPPH自由基的清除率随着浓度增加而增强,且具有明显的量效关系,Vc亦是。瓜蒌皮黄酮对DPPH自由基的IC50为16.09g/ml, Vc的IC50为81.44g/ml,表明瓜蒌皮黄酮对DPPH自由基的清除率明显高于Vc。说明瓜蒌皮黄酮对DPPH自由基有显著的清除作用。图1瓜蒌皮黄酮对DPPH自由基的清除作用Fig. 1 The scavenging effect of flavonoids from pericarpium trichosanthis on DPPH radical.图2 Vc对DPPH自由基的清除作用Fig. 2 The scavenging effect of aseorbie acid on DPPH radical2.2瓜蒌皮黄酮抗脂质体过氧化能力试验结果见图3和图4。如图3和图4所示,瓜蒌皮黄酮对由F2+引发的卵磷脂脂质体过氧化具有明显的抑制作用,抑制率随着黄酮浓度增加而增强,且具有明显的量效关系,vc亦是。瓜蒌皮黄酮的IC50为0.46mg/mL，Vc的IC50为1.52mg/mL,表明瓜蒌皮黄酮抗脂质过氧化能力明显优于Vc。说明瓜蒌皮黄酮具有显著的抗脂质过氧化能力。 图3瓜蒌皮黄酮抗脂质体过氧化能力Fig.3 The capability of flavonoids from pericarpium trichosanthis on inhibiting lipid Peroxidation图4 Vc抗脂质体过氧化能力Fig. 4 The capability of ascorbic acid on inhibiting lipid peroxidation2.3瓜蒌皮黄酮的还原力试验结果见图5.如图5所示,一般情况下,样品的还原力与抗氧化活性有明显的相关性(YenG.C.,1995;DuhP.D.,1997).从图5可以看出,在一定浓度范围内,瓜蒌皮黄酮的还原力随着浓度增大而增强,且具有明显的量效关系,Vc亦是。瓜蒌皮黄酮浓度为0.2mg/ml时,吸光度为0.667,而Vc浓度为0.2mg/ml时,吸光度为0.775,表明软瓜蒌皮具有较强的还原能力,但低于同浓度Vc的还原力。瓜蒌皮黄酮还原力大约是的Vc还原力的0.86倍。说明瓜蒌皮黄酮对Fe3+具有较好的还原作用,但稍差于Vc。 图5瓜蒌皮黄酮和Vc的还原力Fig.5 The redueing ability of flavonoids from pericarpium trichosanthis and ascorbic acid2.4瓜蒌皮黄酮清除超氧阴离子自由基能力邻苯三酚自氧化的机理十分复杂,至今仍不很清楚。邻苯三酚在碱性条件下发生反应,在反应滞后30-45秒后,产生稳定浓度的超氧阴离子自由基(02-)与中间物(M),中间物M又与02-反应,得到一种有颜色的中间产物,此产物在紫外有吸收,能够引起某一波长处吸光值的线性积累,从而来反映抗氧化剂的清除能力的大小。试验结果见图6和图7。如图6和图7所示,瓜蒌皮黄酮具有清除超氧阴离子自由基的作用,清除率随着黄酮浓度增加而增强,且具有明显的量效关系,Vc亦是。瓜蒌皮黄酮的IC50为7.33mg/mL,Vc的IC50为0.39mg/mL。说明瓜蒌皮黄酮对超氧阴离子自由基有一定的的清除作用,但差于Vc。 图6瓜蒌皮黄酮对超氧阴离子自由基清除能力Fig.6 The scavenging effect of flavonoids from pericarpium trichosanthis on superoxide anion radical图7 Vc对超氧阴离子自由基清除能力Fig.7 The scavenging effect of ascorbic acid on superoxide anion radical2.5软枣称猴桃黄酮清除轻基自由基能力轻自由基(OH)是一种氧化能力很强的自由基,可发生电子转移!夺取氢原子和轻基化等反应,可以使氨基酸、蛋白质、糖类、核酸和脂类等发生氧化,遭受损伤和破坏。OH与肿瘤、衰老、辐射损伤以及细胞吞噬有关,与许多疾病的发生有关,因此迫切需要加强对#OH的作用进行研究。试验结果见图 8和图 9。如图 8和图 9所示,瓜蒌皮黄酮具有清除经基自由基的作用,清除率随着黄酮浓度增加而增强,且具有明显的量效关系,Vc亦是。瓜蒌皮黄酮的IC50为9.16mg/mL,Vc的IC50为1.51mg/mL。说明瓜蒌皮黄酮对轻基自由基有一定的的清除作用,但差于Vc。 图8 瓜蒌皮黄酮对轻自由基清除能力Fig.8 The scavenging effect of flavonoids from pericarpium trichosanthis on scavenging hydroxyl radicals图9 Vc对轻自由基清除能力Fig.9 The scavenging effect of aseorbie acid on scavenging hydroxyl radicals3结论瓜蒌皮黄酮具有很好的对DPPH自由基的清除作用和抗脂质体过氧化作用,并且优于Vc；对Fe3+具有较好的还原作用但稍差于Vc；对超氧阴离子自由基和轻基自由基有一定的清除作用但差于Vc。说明瓜蒌皮黄酮具有一定的体外抗氧化活性。4讨论DPPH自由基(二苯基苦味基肼自由基)是一种稳定的以氮为中心的自由基,被用来评价多种天然抗氧化剂的抗氧化活性,在517nrn波长处有最大吸收。DPPH呈深紫色,当有自由基清除剂存在时,由于清除剂与DPPH的孤对电子配对,使其吸收逐渐消失,生成稳定的黄色化合物。褪色程度与DPPH所接受的电子数成定量关系,即与抗氧化剂的供氢能力有关。由于DPPH自由基反应的简便可行性,故已广泛用于检测自由基清除能力的研究中。加入黄酮后,黄酮可以与DPPH自由基结生成合DPPH-PheO,消耗DPPH,降低DPPH的含量,表现出对DPPH自由基的清除能力高于Vc(牛桂玲等,2009)。铁离子可以诱发脂质体氧化,但脂质体氧化开始后所衍生出来的过氧化物自由基, 也会造成油脂的连锁反应,促使油脂