2010年11月生物化学实验设计方案.doc

猪肝过氧化氢酶的提取，纯化，活力测定和动力学分析实验目的：(1) 培养设计实验的能力，团体协作的意识；(2) 深入理解酶的提取，纯化，活力测定和动力学分析；(3) 学会离心机，透析膜，分光光度机的使用。实验原理： 过氧化氢酶（CAT）广泛存在生物体中，特别是绿色植物的叶绿体，线粒体和动物的内脏中。本实验就是应用猪肝中丰富的过氧化氢酶的特点，来展开实验，探究一系列的性质和特点。 CAT为大分子蛋白质不能通过半透膜，在盐析的方法沉淀下来，CAT 作用最适宜的pH接近中性在pH 6.87.5的范围内。酶都具有专一性，CAT作用的底物为过氧化氢，而过氧化氢在405nm，500nm，540nm，629nm处有最大吸收（本实验用500那么进行实验）。用不同浓度下的过氧化氢绘制出标准曲线。酶活力是指酶催某个化学反应的能力。因此测定酶活力实质上就是测定被酶催化的化学反应的速度（v）。酶促反应速度可单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增量来表示。从而求出酶的总活力和比活力。在酶促但应开始后，于不同时间测定反应体系中产物的量，以产物的增加量对时间作图，便得酶促应进程曲线。要真实反应出活力的大小，测定酶促反应初期的速度、即酶反应初速度。酶的底物浓度与酶促反应的速度关系一般情况下符合米氏理论。根据中间产物学说，酶促反应的动力学模型可以表示为E+SESE+PV=(Vm*S)/( Km+S)从米氏方程可见，当V=Vm/2，Km=S，米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。实验测定CAT的Km和Vm，采用最常用的linweaver-burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即： 1/V 1/v=(Km/Vm)*(1/S)+1/Vm1/Slinweaver-burk双倒数作图酶活力是同样受调节控制的，许多化学因子都可以通过与酶分子结合会影响没活力。在酶溶液中，加入不同浓度的Mg2+，测定酶活力的变化情况，判断Mg2+对CAT激活作用的强度;加入不同浓度的Ag+可以观察对CAT的抑制作用。溶液的pH会影响酶的活性。通常各种酶只有在一定的pH范围内才能表现出活性，同一种酶在不同的pH条件下所表现的活性不同，其变现活性最高时的pH称为酶的最活pH。本实验也是根据此性质，在达到反应时间时加入盐酸来终止反应。反应温度同样影响酶的活性，但是试验底物受温度影响较大，本试验固采取在室温条件下进行。实验主要用品1 器材（1） 高速组织捣碎机（2） 离心机（3） 天平（4） 冰箱（5） 秒表（6） 722分光光度计（7） 透析袋2 试剂（1） 双氧水（2） 含0.025mol/LKH2PO4-0.025mol/LNa2HPO4 pH=6.86的缓冲溶液（3） 硫酸铵（分析纯）（4） 0.05mol/L氯化镁（5） 0.1mol/L盐酸（6） 0.1mol/L氯化钡（7） 0.01mol/L盐酸（8） 0.01mol/L氢氧化钠3 材料新鲜猪肝实验步骤1.酶的粗分离，纯化1.1 称量150g新鲜猪肝，加入150mL预先配制的缓冲溶液KH2PO4-NaHPO4 (pH=6.86），于高速组织捣碎机匀浆2min后取出过滤，得到清夜后量取体积，得到具有酶的溶液,留出20mL备用来测量粗酶的活力。1.2 在清夜中加入研磨细粉的硫酸铵固体到饱和度（100mL加21g），缓慢加入，不断搅拌溶解，后静置。1.3 室温离心，收集沉淀物，溶于50mL缓冲溶液中，装入透析袋中，到无硫酸根离子为止（用氯化钡检验）。1.4 取出酶溶液低温离心后取清夜（如条件不允许，此步骤就不做）得到较为纯一些的酶溶液。2.酶的活力测定2.1绘制过氧化氢标准曲线 取15支洁净试管编号，0号一支，1-7各两支，按表操作：管号 0 1 2 3 4 5 6 7 底物浓度（原） 2mol/L(假设)底物的量mL 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5水ml 3.9 3.4 2.9 2.4 1.9 1.4 0.9 0.4缓冲溶液mL2.00.05mol/L氯化镁0.1mL反应时间10min0.1mol/L盐酸2.0mL吸光度以0号试管为对照，测出各试管的吸光度，以底物的绝对量为横坐标，吸光度（500nm）为纵坐标，绘制标准曲线。2.2酶活力测定取干净试管7支编号，0号为空白对照，以缓冲溶液代替酶液。以13号管为粗酶的酶活力测定，13号管为提纯后酶的活力测定。向各管加入3.9ml底物，各管加入相应的酶液（0.1mL），缓冲溶液和氯化镁。反应10min后向各管加入2mL 0.1mol/L的盐酸以终止反应，测定吸光度，从而求出酶活力。3.酶的动力分析3.1 酶促反应初速度取干净试管17支编号，0号为空白对照。18号各两支，按下表操作：编号 012345678底物的量 0mL3.9mL酶液量 0.1mL0.1mL缓冲溶液 5.9mL2mL反应时间min 8123455678盐酸0.1mol/L 2mL吸光度以空白组为对照测出各个反应时间后的底物的量。反应到达相应的时间后应立即用盐酸终止反应后测出各个试管的吸光度。3.2 金属Mg2+离子对CAT酶的激活作用取干净试管9支编号,0号为空白对照,14号各2支,按下表操作：（氯化镁 编号 0 1 2 3 4底物的量 0.1 3.9mL酶液量0.1mL 0.1mL氯化镁0.05mol/L.mL 0 0.1 0.2 0.3 0.4缓冲溶液mL4.90.90.80.70.6反应时间10min盐酸0.1mol/L2mL吸光度通过吸光度的比较计算可以算出Mg2+对CAT的激活能力。3.3底物浓度对酶的影响（Km Vm的测定）取干净试管15支编号，0号为对照， 17号各两支，按下表操作：编号 01234567底物的量mL 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5缓冲溶液 3.8 3.3 2.8 2.3 1.8 1.3 0.8 0.30.05mol/L氯化镁 0.1mL酶液量 0.1mL反应时间 10min盐酸0.1mol/L 2mL吸光度各管在722分光光度计测定500nm的吸光度。从标准曲线上查剩余底物的量从而计算出初速度V。取倒数1/V对1/S作图。求出米氏常数Km和最大反应速度Vm。3.4 pH值对酶活性的影响对于pH对酶的影响在上述的一系列试验中都能体现到（上述终止反应就是加入硫酸使酶变性从而失活）。取干净试管支编号, ,15号各2支,按下表操作：编号 0 1 2 3 4 5底物的量0 3.9mL酶液量 0.1mL0.05mol/L氯化镁 0.1mL