测序图分析.doc

测序常见峰图及原因说明1.PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？2. 什么是碱基缺失？3. 什么是引物不纯？4. 重复结构对测序有哪些影响？5. 什么是模板不单一？6. Poly结构的测序结果是怎样的？7. 含有回文结构的模板测序结果是怎样的？8. 测序峰图为前双峰的结果是什么样的？9. 测序峰图为后双峰是什么样的？10. 无信号的结果：信号值(ATGC的平均值)皆小于10011. 飘峰：这是由于用3.0特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移12. 没有任何干扰的结果Q-1.PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？返回顶端A-1.PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目的片段条带大 小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板本身的情况。需要强调的是，高质量的 PCR产物才可能得到高质量的测序结果，如果您对PCR产物的纯度不很确定，希望您可以将PCR产物进行克隆处理，以确保得到好的测序结果。以下图为例： 该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。查看大图解决办法：改变PCR条件，重新扩增。或者可以将该PCR产物克隆到质粒中，初步筛选后进行单克隆测序。Q-2.什么是碱基缺失？返回顶端A-2.以下图为例：查看大图碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段，上图的186位缺失两个连续的T解决方法： (1) 使用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的目的。或者将该PCR产物克隆到质粒中，挑取单克隆测序。 (2) 如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点，那么可以改变PCR反应条件，重新扩增。Q-3.什么是引物不纯？返回顶端A-3.以下图为例：查看大图引物不纯造成移码现象，该种现象与模板杂在峰图都表现为背景峰较杂，但是引物不纯在峰图上表现的更有规律，一般在每一个主峰前或者后都有一个同一碱基的小峰。解决办法：重新合成引物，或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序。Q-4.重复结构对测序有哪些影响？返回顶端A-4.以下图为例：查看大图重复结构将导致测序复制框的滑移，重复结构之后峰型混乱。解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该重复结构处，即可完成模板全长的拼接。Q-5.什么是模板不单一？返回顶端A-5.以下图为例：(1) 菌液为非单克隆：下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰（插入后双峰），即模板中含有两个或两个以上的相同载体，但是插入片段不同。解决办法：重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。查看大图查看大图(2) PCR产物不纯，如下图所示：查看大图在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在197bp位置有一个高高的A峰，这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。注：PCR产物测序都是以A高峰终止。解决方法：对PCR产物切胶纯化，再进行测序。Q-6.Poly结构的测序结果是怎样的？返回顶端A-6.以下图为例：查看大图查看大图查看大图以polyT为例，在polyA/T结构之后往往出现移码、双峰、套峰现象，而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减或者直接中断。解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。如果是较长的PloyG/C，建议客户使用3.0试剂盒进行测序。Q-7.含有回文结构的模板测序结果是怎样的？返回顶端A-7.以下图为例：查看大图位点94至137是一个回文结构，该结构导致后面的信号衰减，出现错误的判读。解决方法：使用反向引物对模板进行测序，测到该回文结构处，即可完成模板全长的拼接。A-8.测序峰图为前双峰的结果是什么样的？返回顶端A-8. (1) 产物中含有小片段PCR产物；(2) 引物有两个结合位点，其中一个结果中断查看大图解决方法：换引物反向测序。Q-9.测序峰图为后双峰是什么样的？返回顶端A-9.原因和解决方法同回文结构及插入后双峰。查看大图Q-10.无信号的结果：信号值（ATGC的平均值）皆小于100返回顶端A-10.以下图为例：查看大图测序无信号的判定：在确认引物、质粒抽提浓度、反应安排等条件无问题的情况下，测序结果峰型杂乱且信号值小于100的结果；此时则判定结果为测序无信号。两次测序无信号，我们会取消实验。Q-11.飘峰：这是由于用3.0特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移返回顶端A-11.以下图为例查看大图在用特殊试剂盒（3.0）时，会发生碱基替代，从而出现碱基位移的现象，即飘峰。解决方法：用普通试剂盒（3.1）测