断裂蛋白质内含子反式剪接动力学体外反应硕士论文.doc

新型断裂蛋白质内含子体外剪接动力学的研究生物化学与分子生物学， 2010， 硕士【摘要】 蛋白质内含子(intein)是镶嵌在宿主蛋白质中的插入序列,在宿主蛋白质成熟过程中能够自我剪切下来,同时将两侧的序列蛋白质外显子(exteins)通过肽键相连接,形成成熟的蛋白质。蛋白质的这一成熟过程被称为蛋白质顺式剪接(protein cis-splicing)。断裂蛋白质内含子(split-intein)是在蛋白质内含子内部区域特定位点发生断裂,形成N-端蛋白(IN)和C-端蛋白(Ic),分别由基因组上相距较远的两个开放阅读框(open reading frame, ORF)编码。在翻译后成熟过程中,IN和Ic相互识别,重建催化活性中心,介导蛋白质反式剪接(protein trans-splicing)。通过人工改造断裂蛋白质内含子的断裂位点,使之靠近蛋白质内含子的N-末端或C-末端,即形成了新型断裂蛋白质内含子。断裂蛋白质内含子介导的蛋白质反式剪接技术在蛋白质纯化、基因治疗、环状多肽制备以及大分子复杂蛋白质的生产方面已取得了一些成果。新型断裂蛋白质内含子在此基础上扩大了断裂蛋白质内含子的应用,提供了在目的蛋白质的N-末端或C-末端标记任意化学基团的潜力。在进行应用之前需要对这一.更多还原【Abstract】 Intein is an internal protein sequence in host protein precursor. It can autocatalytically self-excise and concomitantly splice together the flanking sequences (N-and C-exteins) with a peptide bond to produce the mature host protein. This process is termed as protein cis-splicing. Split-intein is an intein which splits in specific internal site and two parts of the intein (N-intein and C-intein) encoded by two separate open reading frames located apart in the genome, respectively. In the process.更多还原 【关键词】 断裂蛋白质内含子； 反式剪接； 动力学； 体外反应； 【Key words】 split-intein； trans-spiking； kinetics； in vitro reaction； 摘要 5-7 ABSTRACT 7-8 第一章 绪论 11-27 1.1 引言 11-12 1.2 蛋白质内含子的发现 12-13 1.3 蛋白质内含子的结构和分类 13-15 1.4 蛋白质内含子的剪接机制 15-20 1.5 蛋白质内含子的应用 20-24 1.6 新型断裂蛋白质内含子 24-25 1.7 课题研究的目的、内容和意义 25-27 第二章 实验材料、基本技术和设计方案 27-43 2.1 实验材料和仪器 27-35 2.2 实验基本技术 35-42 2.3 实验设计方案 42-43 第三章 实验过程 43-55 3.1 断裂蛋白质内含子表达质粒的构建 43-47 3.2 前体蛋白质的纯化 47-51 3.3 断裂蛋白质内含子的体外剪接、交叉反应和剪接条件的优化 51-53 3.4 断裂蛋白质内含子的剪接动力学 53-55 第四章 实验结果与分析 55-75 4.1 断裂蛋白质内含子表达质粒的构建 55-58 4.2 前体蛋白质的纯化 58-60 4.3 断裂蛋白质内含子的体外剪接、交叉反应和剪接条件的优化