酵母双杂交自激活现象ppt课件.ppt

1 酵母双杂交自激活现象 2 真核生物的转录因子是由两个可以分开的 功能上相互独立的结构域 domain 组成的 一 原理 酵母的转录激活因子GAL4 在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域 DNAbindingdomain BD C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域 transcriptionactivationdomain AD 3 GAL4分子的BD可以同上游激活序列 upstreamactivatingsequence UAS 结合 AD则能激活UAS下游的基因进行转录 单独的BD和AD都不能激活UAS的下游基因 它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活功能 His gal 7 一般情况下 单独的BD可以与GAL4上游活化序列 GALUAS 结合 但不能引起转录 然而 将一段具有转录激活活性的转录因子基因构建到BD载体上 若其表达产生的BD单独与UAS结合也可以引起下游报告基因的转录 那么就称之为酵母双杂中的自激活现象 反过来 可以利用这种自激活现象来验证某个转录因子是否具有转录激活活性 8 His gal 自激活原理 Transcriptionfactors GAL4BD 9 YPDA培养基 0 2gade定容至100ml 0 2 的ade母液 pH6 5灭菌121 15min 10 正对照 pGAL4负对照 pBD GAL4 11 将 70 下冻存的酵母菌在YPAD平板上划线 倒置于30 培养2 3天 挑取2 4个大菌落 直径2 3mm 于1 5mlYPAD液体培养基中 剧烈震荡5min 打散菌落 接种于50mlYPAD液体培养基中 250ml三角瓶 230 250转 min 30 培养18 24hr 取菌液测定其OD600值 需达到1 5 若不到 再培养1 2hr 若还不到 换单克隆重摇 取50ml菌液于300mlYPAD培养基中 1 2L大三角瓶 30 230rpm 摇培3hr 至OD600值为0 4 0 6 4000rpm5min于常温收集菌体 重复一次 室温下1000g离心5min 去上清 加入50ml超纯水清洗悬浮3次 1000g离心5min 弃上清 用新配的1 5ml1 TE LiAc重悬细胞 置冰上 即成为酵母感受态细胞 只能现做现用 不能贮存 室温只能放置1 2hr 酵母菌株感受态细胞制备 12 酵母转化鲑鱼精DNA 20 g l 沸水中煮20min 冰上冷却10min 加入100 l酵母感受态细胞 1 2 l构建质粒 约200ng 100 g鲑鱼精 600 lTE LiAc PEG 变速涡旋10s 1min至混匀 30 200rpm min 恒温摇床振荡30min 加入70 lDMSO 温和颠倒混匀 42 水浴热休克15min 后冰浴10min 常温下 3000rpm离心10s 弃上清 去干净 用0 5ml1 TE重悬细胞 1 TE室温只能放置1 2hr 将转化后的酵母培养于SD Trp培养基上 30 倒置培养约3 5天 直至出现菌落 13 阳性克隆的筛选 将在SD Trp培养基上长出的酵母菌落转移到SD His培养基上进行筛选 30 培养2天 检查生长情况 对生长状态较好的单克隆进行 半乳糖苷酶活性分析 14 半乳糖苷酶活性分析 酵母克隆滤纸显色分析 取2ml的Z缓冲液 X gal溶液润透2张滤纸 小心取一张滤纸覆盖于生长有转化子的平皿上 用涂布棒小心赶出气泡 使滤纸尽可能与酵母菌接触 1min 用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置 用镊子轻轻取出滤纸 沾有菌的面朝上置液氮中10s 夹出滤纸 室温解冻 重复3次 沾有菌的面朝上 紧贴于预先用Z缓冲液 X gal溶液润透过的那张滤纸上 同时吸掉多余的Z缓冲液