《转基因生物安全与管理》复习资料.doc

转基因生物安全与管理复习资料转基因生物安全与管理主编：薛达元出版社：科学出版社转基因 题型 单选 1分X 25 判断 1分X 10 名解 3分X 5 填空10分简答 5分X 4 论述10分X 2第一任课老师绪论：什么叫转基因生物，第一个转基因动植物出现的时间，转基因作物在中国和世界范围的商品化概况（分布、种类、目标性状等）。绪论1) 转基因生物(GMO)：采用基因工程手段将从不同生物中分离或人工合成的外源基因在体外进行酶切和连接，构成重组DNA分子，然后导入受体细胞，使新的基因在受体细胞内整合、表达，并能通过无性或有性增殖过程，将外源基因遗传给后代，由此获得的基因改良生物称为转基因生物。2) 转基因生物及其分类：转基因动物(GMA) 转基因植物(GMP) 转基因微生物(GMM) 转基因作物(GMC) 转基因食品(GMF)5) 转基因植物的发展：自1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有120多种植物转基因获得成功。1996年全球大面积种植，并不断扩大。2004年达到8100万公顷,是1996年的48倍.2006年 1.02亿公顷2007年 1.143亿公顷.预测：2020年世界上80 -90的农作物将是转基因植物. 分布:2004年有17个国家种植商品化转基因植物:美国（59%）、阿根廷（20%）、加拿大（6%）、中国（5%）、欧洲很少6）转基因植物的种类：粮食作物：水稻、小麦、玉米、高粱、马铃薯、甘薯等；经济作物：棉花、大豆、油菜、亚麻、向日葵等；蔬菜：番茄、黄瓜、芹菜、甘蓝、花椰菜、胡箩卜、茄子、芹菜等；瓜果：苹果、核桃、李、番木瓜、甜瓜、草莓、香蕉等；花卉：矮牵牛、菊花、番石竹等；树木：泡桐、杨树等。目标性状: 两种转基因类型占主导地位: 抗除草剂：最早进入田间实验，种植面积最大 2000年使用抗除草剂大豆、玉米和棉花占转基因作物74%。 抗虫：2000年，Bt玉米、 Bt棉花占19%。新型的转基因作物:生物燃料的转基因作物种植面积增长很快，在美国，40%的转基因玉米种植面积是用来生产乙醇的 .2003年，我国转Bt抗虫棉种植面积已达270万公顷，占棉花总面积的60%。 我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。第1,2章转基因技术原理：转基因技术的主要过程；基因工程载体的种类及良好的载体所具备的功能；动植物转化的受体系统；转基因方法（农杆菌介导转化法、基因枪法、体细胞核移植法等）；目的基因与报告基因，转化体在DNA/RNA/蛋白质三个水平的鉴定方法。1）转基因技术主要过程1、目的基因的获取 2、含有目的基因重组质粒的构建3、受体材料的选择和转化系统的建立 4、转基因方法的确定和外源基因的转化5、转化体的筛选和鉴定 6、转基因生物的育种利用 转基因的重组子构建技术 -构 重组分子导入宿主休内的转化技术 -转 转基因在受体细胞染色体上的稳定整合 -整 转基因的可控性表达技术 -表载体(vector)：在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。基因工程载体必须具备以下几个功能容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。 能在宿主细胞中稳定地复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供在受体细胞内复制或整合的能力为外源基因提供在受体细胞内的扩增和表达能力载体种类克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。三种最常用的载体：质粒 噬菌体 动植物病毒 植物基因转化受体系统：是指用于基因转化的外植体，通过组织培养途径或其他非组织培养途径,能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，转化选择对抗生素敏感的再生系统。（受体是指用于接受外源DNA的转化材料）不同的受体系统适应不同转化方法的要求和不同的转化目的，具体操作时应根据植物种类、基因载体系统及实验设备等因素选择应用。受体材料的选择 良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件：1、高效稳定的再生能力；2、受体材料要有较高的遗传稳定性；3、外植体来源方便，如胚和其它器官等；4、对筛选剂（选择性抗生素）敏感；5、转化率高常规的植物基因转化受体系统 1 2 3 4 一、原生质体受体系统原生质体:去除细胞壁后的“裸露”细胞,具有全能性，恢复细胞壁具有分化再生能力，能在适宜的条件下诱导出再生植株，是应用最早的再生受体系统之一。可以利用物理或化学的方法改变细胞膜的通透性，使外源DNA进入到细胞内并进行整合表达，从而实现植物基因转化。已有烟草、水稻、小麦和玉米等250多种植物原生质体培养获得成功。优点：1、DNA易导入细胞，高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质;2、获得基因型一致的克隆细胞，由原生质体再生所获转基因植株嵌合体少;3、可适用于多种转化方法，如电击法、PEG法、脂质体介导法和显微注射法等；缺点：培养技术难度大，培养周期长，不易制备；再生困难；培养所形成的无性细胞系变异程度高，遗传稳定性差。二、愈伤组织受体系统愈伤组织：无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，在伤口表面形成新的组织。这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。优点：1、由脱分化的分生细胞组成,易接受外源基因，转化效率高；2、外植体来源广,多种外植体可经组织培养诱导产生愈伤组织；3、可继代扩繁，繁殖快,因此可以由转化愈伤组织获得大量的转化植株.缺点：诱导的愈伤组织常是由多细胞形成，易形成嵌合体，筛选难度高；形成的再生植株无性系变异较大，遗传稳定性差.三、种质系统（生殖细胞）种质系统：以植物的生殖细胞如花粉粒、卵细胞等为受体细胞进行外源基因转化的系统。优点：1、生殖细胞不仅具有全能性，而且接受外源遗传物质能力强，成功率高，更易获得转基因植株。2、生殖细胞是单倍体细胞，转化的基因无显隐性影响，能使外源基因充分表达，有利于性状选择。缺点：受到季节和生长条件限制四、胚状体受体系统 最为理想的受体系统胚状体：是指经体细胞胚发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构，又称为体细胞胚。有些植物自然条件下其珠心组织等可自发形成胚状体；植物组织培养过程中，一些体细胞及单倍体细胞经诱导也可形成胚状体。这些胚状体与经受精形成的有性胚一样，在一定条件下可发育成完整植株。优点：1、接受外源基因能力强，转化效率高；2、胚状体个体间遗传背景一致，无性变异小；3、嵌合体少，易于培养、再生。缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。动物基因转化的受体系统一 单细胞受精卵单细胞受精卵为靶细胞：利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。目前应用较广泛，最早最经典的方法。二 胚胎干细胞（ES细胞）胚胎干细胞：ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系,能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。三 精子载体精子载体：直接以精子作为外源DNA载体的转基因方法.有充分的实验证据证明动物精子可以结合DNA，但精子质膜能否吸收与转运外源DNA，并允许其进入细胞质，甚至细胞核，仍然存在争议。原理：将成熟精子与外源DNA共培养，成熟精子与外源DNA预培养之后，使精子有能力携带外源DNA进入卵子中，使之受精，并使外源DNA 整合到染色体中四 体细胞与动物克隆技术相结合：以动物体细胞为受体，将目的基因导入能传代培养的动物体细胞，再以这些动物体细胞为核供体进行动物克隆，从而得到带有外源基因的转基因动物。转基因方法的确定和外源基因的转化A 植物基因的转化第一种是间接转移法。农杆菌介导转化法:它是以土壤杆菌为媒介，将克隆在Ti质粒载体(或Ri质粒载体)上的目的基因，通过细菌与植物细胞之间的接合作用，而转移到植物细胞并整合到它的染色体基因组上; 植物病毒载体介导的转化法第二种是直接转移法它是将编码目的基因的DNA分子，通过诸如化学刺激法、电脉冲法、电激注入法以及生物弹击法等，直接转移到植物细胞中。直接和间接主要指外源DNA进入受体细胞的方式农杆菌介导的转化法 （间接转移法） 【非常重要】植物冠瘿瘤植物的一种癌症植物与人一样，可以产生各种各样的瘤和癌。其中一类瘤被叫作瘿，瘿的种类很多。引起瘿的因素有：受伤、昆虫、病毒、细菌和特定的基因组织表达等。人们最感兴趣的瘿是冠瘿瘤。 冠瘿瘤的起因是由根癌农杆菌对植物的侵染而引起。根癌农杆菌和发根农杆菌均是革兰氏阴性菌，分类地位是根瘤菌科、农杆菌属（土壤杆菌属）根癌农杆菌在土壤中含量丰富，可通过植物伤口侵染多种植物，尤其是双子叶植物。细菌DNA中的编码基因转化植物,在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂,受侵染的植物形成冠瘿瘤.根癌农杆菌转化植物细胞的能力:根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒，简称Ti质粒。Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，分子量为95156106D约有200kb。低于30摄氏度可稳定存在与根癌农杆菌中。 Ti质粒的结构与功能Ti质粒除了诱导的植物产生冠瘿瘤外还有以下功能：1、赋予根癌农杆菌附着于植物细胞壁的能力；2、赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力；3、决定根癌农杆菌的寄主范围；4、决定冠瘿瘤的形态和冠瘿碱的成分；5、参与植物细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素的代谢活动。Ti质粒的功能区域（1）T-DNA区（transferred-DNA regions）： 农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。（2）Vir区（virulence region） 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。（3）Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。（4）Ori区（origin of replication） 该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。野生型Ti质粒的障碍 Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体，但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在着许多障碍： （1）质粒分子量过大过大，比pBR322质粒大50倍左右，操作困难 （2）大型的Ti质粒有多个酶切位点 （3）植物激素类的影响: T-DNA区内含有许多编码基因，其中Onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生； （4） Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增； （5） Ti质粒中存在不起作用的序列Ti质粒的改造1保留T-DNA的转移功能,去掉其致瘤性;2加入多克隆位点;3具有目的基因表达所需要的启动子、终止子以及供重组细胞筛选的标记基因等;4具有在大肠杆菌中进行复制的DNA复制起始位点，某些载体还同时带有可在农杆菌中进行复制的起始位点。Ti质粒介导的遗传转化方法：叶盘法、原生质体共培养、整株感染法等基本程序：重组Ti质粒的工程菌的培养及转化；选择合适的外植体；工程菌与外植体共培养；外植体脱菌及筛选培养；转化植株再生等。叶盘法n 用无菌不锈钢打孔器从叶片上取下圆形小片，即所谓叶盘，接种上含有重组Ti质粒的根瘤土壤杆菌。在平皿的滤纸上培养2天后，将滤纸连同叶盘转移到含有适量的卡那霉素的“长芽”培养基中，进行筛选与再生，接着再转移到“生根培养基” 上诱导幼芽生根，最后将小植株移栽在土壤中. n 适用性广，能被根瘤土壤杆菌感染的、并能从叶片外植体再生植株的各种植物都可适用。操作方便简单，获得转基因植株的周期短并具有很高的重复性，便于在实验室内大量常规培养 原生质体共培养转化法n 实验流程：以原生质体作为受体细胞，并与携带外源目的基因的农杆菌共培养；洗去残留的农杆菌，置于含抗生素的选择性培养基上筛选出转化细胞；再生植株。n 与叶盘法比较，转化体不含嵌合体，先决条件是建立良好的原生质体培养和再生体系整株感染法：用根癌农杆菌直接感染植物操作程序：用刀切或针刺等在健壮的幼上造成伤口，将携带外源目的基因的农杆菌的溶液直接涂在植物伤口上，使农杆菌通过伤口感染植株；将感染部位的薄壁组织切下放入选择性培养基中进行愈伤组织的诱导；愈伤组织转移至合适的培养基上再生植株。农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质粒(root-indcingplasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。农杆菌介导的基因转化系统的应用应用最早和最广泛的方法,80%转基因植物由此法获得，优点: 1、天然的转化载体系统，再生效率高； 2、转移的外源基因通常为单拷贝，很少发生基因沉默，遗传稳定； 3、费用低、方法简单容易操作缺点：不适合单子叶植物遗传转化（可能单子叶植物缺少某种特殊的愈伤应答因子而难以转化，近年来取得重大突破，如玉米的遗传转化）基因枪法（微弹轰击法、生物炸弹法、粒子加速法等）【非常重要】原理：将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。根据动力系统的不同,将基因枪分为三种类型:利用火药爆炸力作为驱动力;利用高压气体作为驱动力;以高压放电作为驱动力.最早于1987年由Cornell最早研制火药基因枪,此后其他类型的基因枪相继出现,并在实际应用中不断改进和发展,成为农杆菌介导的转化法之后又一广泛应用的转化技术.优点:1、步骤简单易行;2、无宿主限制，无论是单子叶还是双子叶植物都可以应用3、受体可以是各种外植体、愈伤组织及胚性细胞等，适合于大多数细胞或组织，不必制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。缺点:相对于农杆菌来说转化率低得多；所需仪器比较昂贵,转化成本高；外源DNA整合机理不清楚,嵌合体比率高；遗传稳定性差；导入的基因通常是多拷贝的，容易引起共抑制现象。常用植物基因转化方法特点比较转化方法农杆菌法PEG法电击法微针注射法基因枪法花粉管通道法受体材料完整细胞原生质体原生质体原生质体完整细胞卵细胞宿主范围有无无无无有性繁殖植物组培条件简单复杂复杂复杂简单无嵌合体比例有无无无多无操作复杂性简单简单复杂复杂复杂简单设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵便宜工作效率高低低低高低单子叶植物应用少可行可行可行广泛广泛植物基因转化系统的选择原则1、对农杆菌敏感的植物应首先试用农杆菌载体转化系统，因为农杆菌转化是在理论和技术操作上都比较成熟的转化系统，而且转化效率高，转化植株的遗传稳定性最好。2、原生质体培养容易的植物应该选择直接转化系统，其优点是既能获得高的转化率，又能克服转基因植株嵌合体的难题。3、转化难度大的植物，既对农杆菌转化不敏感，原生质体培养困难的植物，应采用基因枪法。4、子房中多胚珠植物可试用花粉管通道法，因为涂抹在柱头上的外源DNA可以随着许多花粉管进入子房，分别导入各卵细胞中，提高转化率。B 动物基因转化的方法五、体细胞核移植法（转基因克隆）【重要】 将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活），将重组胚进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。1997年2月17日，英国科学家：1只六岁母羊的乳腺上皮细胞成功的克隆到了一只绵羊 (Dolly)。人类第一次采用分化的体细胞作为供体细胞，它的成功是20世纪生物学重大突破之一。学术意义在于证明分化的体细胞甚至是分化终端的体细胞核仍有全能性。克隆动物(区别于转基因动物)克隆（clone，cloning） 即无性繁殖，是指由一个细胞或个体以无性方式重复分裂或繁殖所形成的一群细胞或个体。克隆动物（cloning animal） 是利用显微技术，将一个体细胞核移植到一个去核的卵细胞中，再植入母体子宫，便可不经授精而发育成的一类动物。 优点：外源基因整合率高，不仅具有“ES细胞途径”的全部优点，且物种适用面广。无需经过嵌合体育种就可获得纯合个体，周期短，效率高。缺点： 技术上难度大， 成功率极低， 胚胎死亡率高， 非一般实验室可以开展。 基因转化后筛选与鉴定的步骤第一步：筛选转化细胞：在含有选择压的培养基上诱导转化细胞分化；第二步：对转化体进行分子生物学鉴定：目的基因的整合与表达检测；第三步：性状鉴定：证明转基因生物是否产生由目的基因编码的特异蛋白质影响代谢而产生的目标经济性状；第四步：遗传学分析：证明目的基因及其控制的目标性状能否稳定遗传及其遗传规律。筛选和鉴定的方法1.按检测的基因功能来划分:调控基因(启动子、终止子等）检测法、选择标记基因检测法、报告基因检测法、目的基因直接检测法2.按检测的不同阶段划分：DNA整合水平检测法、RNA转录水平检测法、翻译水平检测法基于报告基因/选择标记基因的检测（转化子细胞的筛选）一、选择标记基因1.转化载体上除了带有目的基因外，大多还携带选择标记基因，以供转化细胞筛选使用。2.将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因，克隆到质粒载体上，与目的基因同时进行转化。3.功能:选择标记基因的产物给予细胞产生一种选择压力，致使未转化细胞不能生长、发育与分化。而转化细胞对该标记产生抗性，不影响其生长等，从而将转化细胞选择出来.转化细胞筛选的方法n 主要有两种：一是根据选择基因的特点在筛选选择培养基中加入能抑制非转化细胞生长的有毒物质（如抗生素、除草剂等），选择基因通常为一种解毒基因，可以解除培养基中有害物质对细胞生长的抑制作用，这样只有转化细胞才能生长繁殖；另一种方式是，受体细胞为营养缺陷型细胞，在选择性培养基中不能生殖，而转化细胞可以补偿这种缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常生长常用选择标记基因n 抗生素抗性基因n 除草剂抗性基因机理: 标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。二、报告基因n 报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源目的基因是够成功地导入体细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。它应用不依赖于外界选择压力的存在，这一点也是它与选择标记基因的区别之处。理想报告基因的基本要求：1、受体细胞不存在相应的内源等位基因的活性。2、它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。3、具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。目前最常用的报告基因有n 1、 -葡萄糖苷酸酶基因（gus） n 2、荧光素酶基因(luc)n 3 、绿色荧光蛋白基因(gfp)n 4、胭脂碱合成酶（NOS）和章鱼碱合成酶（OCS）转化体的进一步鉴定和证实 通过筛选得到的初步证明目的基因进入受体细胞。至于目的基因是否整合到受体核基因组、是否表达，还必须对转化体进一步检测。(1)DNA水平的鉴定n 检测内容：是否整合、拷贝数、整合位置。n 检测方法：特异性PCR（以外源基因两侧序列设计引物） Southern-blot（外源目的基因序列为探针）PCR检验外源基因的整和n 在转基因个体的检测中,通过设计外源基因两端的特异引物,采用PCR基因可以使外源基因得到大量扩增,然后通过琼脂糖凝胶电泳检测特意扩增带的有无,从而判断外源基因是否整合到受体生物的基因组.n 优点 :由于对模板DNA的要求少,适合与转基因体的早期检测. 缺点: PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩增，容易受到外界因素的干扰.Southern-blot检测外源基因的整合n 原理:来源不同但具有互补序列的两条多核苷酸链通过Waston-Crick碱基配对原则形成稳定的结构.其中一条被标记成为探针,探针与互补的核苷酸序列杂交,通过放射自显影技术可以被检测出来.n 杂交方式: Southern斑点杂交（假阳性率较高） Southern印迹杂交(最常用) Southern原位杂交染色体原位杂交（基因整合位点）外源基因的整合拷贝数n 单拷贝单位点插入n 串联多拷贝单位点插入n 多拷贝多位点插入 大多数情况下以单拷贝单位点整合。农杆菌介导的转化拷贝数比较少，常为1-3个拷贝，整合位点特异性较强；DNA直接转化法拷贝数相差较大，1-50个拷贝，且整合位点随机性较强。(2) 转录水平的鉴定n 验证外源基因是否表达：通过Southern杂交可以得知外源基因是否整合到植物染色体上。但是，整合到染色体上的外源基因并不一定表达。n 常用的方法:RT-PCR检测 Northern-blot技术（标记的RNA为探针对总RNA杂交） 组织细胞mRNA原位杂交RT-PCR检测n 适用范围:外源基因在受体细胞是否转录的初步检测.n 原理:以转基因个体总RNA或mRNA为模板进行反转录,然后PCR扩增,如果可以获得特异的cDNA扩增条带,则表明外源基因实现了转录.n 优点:简单快速,对mRNA抽提的数量和质量都要求不高.Northern-blot检测外源基因的表达n 与Southern-blot不同是:固体膜上转移固定的是总RNA或mRNA.探针与膜上RNA形成RNA-DNA杂交双链.通过放射自显影的强度可以判断外源基因的表达水平.n 分类: 斑点杂交 (假阳性率高) 印迹杂交 (比较常用)组织细胞mRNA原位杂交n 将核酸杂交技术与组织细胞学实验技术结合起来，对特异mRNA序列进行组织细胞分布的空间和时间定位。（3）翻译水平的鉴定n 为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译，还必须进行翻译或者蛋白质水平检测n 主要方法： Western-blot技术 免疫检测(ELISA)Western-blot检测外源基因表达的产物n 适用范围:检测外源基因在蛋白质水平上的表达.n 原理与程序：从转基因材料中提取总蛋白或者目的蛋白,经SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳把蛋白质按分子大小分离,在转移到固体膜上,然后加入特异抗体.膜上的目的蛋白与一抗结合,再加入带标记的二抗,最后通过二抗上的标记物的性质进行检测.ELISA检测外源基因蛋白的表达n 酶连免疫吸附法的简称，利用免疫学原理检测抗原、抗体的技术。n 技术特点：抗原与抗体的反应通过酶反应来检测，由于酶反应的放大作用，使测定的灵敏度极高；同时，酶反应还有很强的特异性。n 程序：抗体的制备、抗体或抗原的包被（固定在固相载体表面，亦称包埋）、免疫反应及检出n 优缺点：灵敏，但易出现本底过高（与载体的非特异性的结合、植物内源性的酶的影响、抗原或抗体的不纯使特异性下降）转基因生物的遗传特点n 少数外源基因整合到生物体能稳定遗传，正常表达，符合孟德尔遗传 大多失活或表现复杂的遗传方式。n 原因：外源基因受宿主基因组排斥而发生片段丢失、重排；多拷贝；整合随机性第3章转基因技术的发展和应用：转基因植物、动物、微生物的应用。一转基因植物的应用领域抗虫的转基因植物 耐强光和紫外辐射的转基因植物抗病的转基因植物 耐碱性土壤的转基因植物抗除草剂的转基因植物 利用转基因植物作为生物反应器。品质改良的转基因植物 其他方面的应用（固氮、环境治理等）。耐旱、耐盐、耐涝、抗寒、耐热的转基因植物种植转基因作物的国家：2008年达25个，美国、阿根廷、巴西、印度、加拿大、中国等。种植作物的特性: 抗除草剂、抗虫占主导地位。作物种类：世界范围商品化面积和规模最大的四种转基因作物为 大豆、玉米、棉花、油菜二、转基因动物在医学领域中的应用1、建立诊断和治疗人类疾病的转基因动物模型：通过精确失活活增强某些基因表达制作各种各样的动物模型。模拟人类疾病的发生和发展规律，并为试验各种可能的治疗方法提供有效地方案。2、器官移植：利用作为组织器官的来源进行人类器官移植。目前供体动物研究较多的是猪，因其发育不同时期的器官与人的器官在大小和生理上比较接近。3、应用转基因动物乳腺生物反应器生产药用蛋白：利用血液、尿腺、乳腺（最理想的具有高度合成和分泌能力的器官）等生产药用蛋白。把转基因动物作为廉价的、活的制药厂。几十只转基因动物就相当于目前一个大型制药厂的生产能力。三、转基因动物在生产中的应用1、提高动物生长速度2、动物抗病育种：如病毒病3、提高动物产量4、改善动物产品质量5、提高产毛能力一、转基因微生物在农业生产领域的应用1、转基因微生物农药：转基因Bt菌剂、转基因病毒杀虫剂、防治病害的转基因工程菌等。2、转基因微生物肥料：利用转基因微生物直接作为生物肥料（重组固氮微生物）或提高作物对一些养料的利用率（如加强对磷钾等的溶解和利用）等。3、转基因饲料酶制剂：利用转基因微生物生产饲料酶制剂，提高饲料酶的活性、稳定性和耐热性等。二、转基因微生物在食品生产领域的应用n 尚无直接用转基因微生物作为食品的报道。n 利用转基因细菌和真菌生产酶用于食品加工已经比较普遍，如奶酪生产使用的凝乳酶、啤酒和饮料生产中的淀粉酶、面包等食品生产中的蛋白酶等。n 优点：产量高、品质均匀、稳定性好、价格低廉等。三、转基因微生物在药物生产领域的应用n 将原本难以大量获得的细胞因子、激素和酶类等重组DNA分子导入大肠杆菌、酵母等微生物生产大量的多肽或蛋白质药物，实现规模化生产。n 目前应用最广的是人胰岛素，发达国家三分之二糖尿病患者所用的胰岛素是基因工程药物。四、转基因微生物在其它领域的应用n 环境保护：利用基因工程菌的方法构建工程菌，处理工业和生活产生的废弃物。如：1980年美国，可吞噬石油的转基因微生物，可用于清除海洋中泄露的石油；利用工程菌清理工业废水和生活污水中的重金属等。n 传统工业改造：传统工业是通过高温高压手段达到目的的耗能过程，而利用转基因技术可在低温常压下降低能耗达到同样目的。n 新能源开发和利用：利用转基因手段生产工程菌，提高发酵效率，以稻草、木屑、植物秸秆、食物下脚料等作为原料生产酒精等。第二任课老师第四章1当前美国转基因作物的种植和推广情况美国在转基因生物的研究、发展、种植和推广上全球领先。通过美国环保署（EPA）或者美国动植物健康检验局（APHIS）的相关批准，并向食品药品管理局（FDA）完成咨询程序，提交转基因食品安全性报告(程序简单)，FDA如果没有发现特殊的安全性，就不在进行特别的与常规食品不同的监督。1. 1991年2月，美国制定“调动全部力量进行转基因技术开发并促进其商品化”；2. “罗马宣言”之后，美国推广转基因农产品商业化，扩大种植面积；3. 目前，美国是世界上种植转基因作物最大的国家，种植面积超全球一半，美国零售商品60%以上为转基因成分，90%以上的大豆，50%以上的玉米是转基因的，转基因产品已经占到美国农业和食品出口的35%。2转基因食品产生潜在健康影响可能的原因包括预期效应和非预期效应，所指内容是什么？通过基因工程手段将一种或几种外源性基因（DNA）转移至某种特定生物体（动、植物和微生物等）中，并使其有效地表达出相应的产物（多肽或蛋白质），这样的生物体直接作为食品或以其为原料加工生产的食品就叫作转基因食品。预期效应和非预期效应,即指人们通过基因修饰所预期得到的性状以及由于基因插入而导致的额外性状。3转基因技术产生的转基因食品可能会产生致敏蛋白，一般选用树状分析方法进行评价 ，而转基因食品需要进行蛋白质致敏性评价的基本内容有那些？4理解标记基因的作用，在选择压力下，不含标记基因的转基因生物是不能存活； 标记基因是帮助对转基因生物体进行筛选和鉴定的一类外源基因，包括选择标记基因和报告基因，通常它们和目的基因一起转移到受体。其作用：转基因作物在实验室阶段经常要用抗生素作为抗性标记进行筛选；选择标记基因用于植物遗传转化中促进转化细胞、组织和转基因植株的生长。在选择压力下，不含标记基因则无法存活。5实质等同性原则是食品安全行评价最基本原则。简述你对实质等同性原则的理解，如何根据实质等同性原则开展转基因食品安全性评价？ 谈谈你对转基因食品安全评价的认识。实质等同性原则即生物技术产生的食品及食品成分，如果与一种现有的食物或食物成分在实质上是相当的，则可以认为是安全的。对实质等同性的理解强调了转基因食品安全性的目的，不是要了解该食品的绝对安全性，而是评价它与非转基因食品的同类食品比较的相对安全性。在评价时注重“个案分析”，即对转基因食品的安全性不一概而论、而是采用“实质等同”一对一地进行个案分析它们的安全性至少不低于相应的参照食品或不会增加来自食品的风险根据实质等同性原则开展转基因食品安全性评价(1)如果两者本质是相同的，用传统的安全性评价程序对转基因食品评价。(2)如果在一定范围内有差别，用集中于对产生差别的因子进行评价。(3)如果氨基酸序列与已知蛋白毒素的氨基酸序列是同系物，则要进行毒理学实验。(4)如有蛋白质产生了抗营养作用，或营养成分发生改变，则要进行营养学评价。(5)如果两者完全不同或没有可比的传统食品 ，则要特别设计动物模型试验证明其无毒后，还须进行人体营养学试验。第5章1. 转基因逃逸是指转基因植物中的外源基因通过基因漂移(或天然杂交)转移到植物的非转基因品种或其野生近缘种(包括杂草种类)的现象。2. 基因流是原遗传学中的概念，指一个孟德尔群体的遗传物质向另一个孟德尔群体移动的现象。基因流可以发生在一个群体的个体之间、同一区域的临近不同群体之间、不同区域的群体之间和具有不同亲缘关系的物种之间。3. 群体遗传学是应用数学和统计学的方法研究群体中基因频率和基因型频率的变化，以及影响这些变化的选择效应和突变作用，还研究迁移和遗传漂变与遗传结构的关系，由此来探讨生物进化的机制并为育种工作提供理论基础。4. 基因流可以通过三种途径实现外源基因的逃逸，即通过花粉漂移、种子传播和无性繁殖器官的移动进行遗传物质的交换。5. 涉及概念-群体选择、个体选择和广义适合度：一个种群如能分割为彼此不相同的小群，则自然选择就可能在各小群之间发生，这样的选择称为群体选择。例如，许多鸟类有领域性行为，对入侵其领域的同种其他个体发起攻击，从而使种群分为不同社群等级的小群，这样有利于把种群密度调节到最适水平。小群由亲缘个体组成，则出现亲缘选择。亲缘选择多与利他行为有关。达尔文所指的自然选择通常指个体选择。个体选择论者认为，在自然选择过程中，基因都是自私的，因此没有亲缘和群体选择的可能。哈密顿（W.Hamilton）等提出广义适合度概念：是指包括个体的适合度及其有亲缘关系个体的适合度，又称总适合度，他把利他主义和自私基因结合起来，即基因总是自私的，但由自私基因所决定的行为（表现型）可以是利他或利己的。利他行为在自然选择过程中的作用是：作出牺牲的个体，对未来世代的遗传作出贡献。6. 转基因从转基因作物向其野生近缘种的逃逸：由于杂交渐渗的遗传同化过程和湮没效应影响了野生群体的遗传完整性, 甚至导致野生近缘种群体的局部灭绝, 从而带来生态风险 。7. 几个遗传学概念遗传同化作用：也有人称为遗传均一化，多指两个可相互杂交种群中的一方个体数量远大于另一方时，两者的相遇将使小种群个体更多地与大种群的个体交配（ 杂交），减少了小种群个体之间交配产生属于自己“ 纯”后代的比例，从而被大种群“ 稀释”掉。群体的湮没效应：表现为当作物与其野生近缘种杂交后代的适合度低于其野生亲本时, 连续的杂交和渐渗过程就导致该野生群体的规模逐渐变小, 甚至威胁到该野生群体的生存。选择性剔除效应则：是指重组到野生近缘种群体基因组上的作物基因及其相连锁的其他基因, 在自然界中负向选择(negative selection)的作用下, 遗传多样性在基因组水平上下降或被剔除的现象。 8. 杂交(或天然杂交)可以理解为植物物种或群体中任何有遗传差异的个体之间通过传粉受精产生后代(杂种)的过程；杂交的过程往往导致基因从一个物种或群体向另一个物种或群体转移; 9. 渐渗(或遗传渐渗)则可以定义为基因或遗传物质通过群体中的杂种个体与亲本个体之间的回交而不断在群体内转移的过程。渐渗过程往往导致群体内基因的不断扩散。 10. 转基因逃逸的重要步骤：转基因植物的外源基因通过天然杂交逃逸到植物野生近缘种必须包括两个重要的步骤: n (1)转基因通过基因漂移(或天然杂交)逃逸到野生近缘种的群体中;n (2)转基因通过遗传渐渗在野生近缘种群体中存留和扩散。 11. 杂交渐渗的进化意义主要包括以下几个方面:n (1)群体内遗传多样性的产生与维持; n (2)适应性进化的产生及其在群体中的转移; n (3)物种或群体中新生态型或新物种的形成; n (4)群体间原有的遗传隔离被打破; n (5)对物种传播和定居的促进 。12.转基因逃逸到野生近缘种或杂草群体后能否带来生态风险, 在很大程度上取决于以下两方面的因素：第一, 转基因逃逸频率的高低。大量转基因不断通过杂交转移到野生近缘种群体会产生所谓的湮没效应, 使单一基因型取代群体中的多基因型或遗传完整性, 进而导致群体遗传多样性的丧失, 潜在风险加大。第二, 转基因是否会改变野生近缘种或杂草群体的适合度。适合度决定转基因在野生或杂草群体中的遗传渐渗和扩散速度, 如果转基因能为野生和杂草个体带来明显的适合度优势, 即使其逃逸的频率很低, 也会在群体中快速地扩散开来。 13. 一个外来基因(如转基因)转移到野生群体之后是否能够成功进行遗传渐渗, 要取决于以下几个方面的因素:第一, 转基因必须通过染色体的配对和交换重组(整合)到野生物种的遗传背景中, 否则就会在自然选择的作用下丢失。第二, 外来基因所在的基因组与野生物种的基因组之间要有较高的同源性和较高的遗传重组率, 从而保证外来基因整合到野生物种的基因组中。如果外来基因所在的基因组不能与野生物种基因组产生交换, 或者即使能产生交换但外来基因由于与不育基因紧密连锁, 遗传渐渗也很难发生。第三, 由杂交产生的、包含外来基因的杂种个体或回交个体必须有较高水平的育性以及正常的生长繁殖能力, 以确保外来基因能够正常传递下去。 14.思考题n 转Bt基因抗虫棉花，其主要靶标生物是哪类生物？鳞翅目昆虫n 一般转基因生物外源基因逃逸的基因流是指什么基因流？水平基因流和垂直基因流n 基因流可以通过三种途径实现外源基因的逃逸。对转基因油菜可能导致的生态风险，最大的担心就是转基因逃逸；野生稻的遗传资源不断受到栽培稻的侵蚀，主要是由于基因渐渗； n 外缘基因可以逃逸到哪几种不同类型植物中？ 一般情况下转基因可以逃逸到三种不同类型植物中：转基因植物的非转基因栽培品种、野生近缘种和杂草类型。n 靶标害虫对转基因植物的适应速度主要取决于害虫野生种群中抗性等位基因的频率，很多生态学和遗传学因素影响靶标害虫对转Bt基因植株进化出抗性的速度，这些因素包括那些？ 1. 暴露于转基因作物中Bt蛋白害虫的世代数； 2. 害虫种群暴露于转基因作物中Bt蛋白的百分比； 3. 由Bt蛋白引起的害虫杂合个体的死亡率； 4. 成虫活动和交配的模式； 成虫大部分在本地活动，但也有可能进行长距离迁移5. 幼虫的移动； 幼虫可以在同一田地内不同植株上移动6. 携带抗性等位基因害虫个体的适合度。n 适合度、基因流、遗传同化作用、群体湮没效应、（群体遗传学） ，认识群体遗传学和转基因生物的生态风险之间的联系。（1）要对转基因逃逸的生态风险进行科学评价, 就必须明确转基因逃逸带来的危害性以及危害发生的可能性。在自然选择作用下, 适合度越高的基因型或个体, 向后代传递自身基因的能力也越强。 （2）转基因一旦逃逸到野生近缘种的自然群体中而又能够带来较高的适合度利益, 则有利于该转基因在野生群体中迅速扩散, 加速渐渗的遗传同化和湮没作用并带来不可预测的生态后果。n 转基因植物的外源基因通过天然杂交逃逸到植物野生近缘种必须包括哪两个重要的步骤，简述转基因逃逸的环境安全评价方法和内容。 理解基本程序和方法。1.转基因植物的外源基因通过天然杂交逃逸到植物野生近缘种必须包括两个重要的步骤: (1)转基因通过基因漂移(或天然杂交)逃逸到野生近缘种的群体中;(2)转基因通过遗传渐渗在野生近缘种群体中存留和扩散。 2.基因逃逸的环境安全评价方法和内容：n 按照风险评价的基本原则, 任何风险的大小为相关事件的危害性(hazard)与发生这种危险性事件的概率(exposure)的函数。n 即风险(%)危险性发生概率(%)。n 对于转基因逃逸及其环境生态后果而言, 风险则是由转基因逃逸的可能性(发生概率)和逃逸的转基因是否会对环境有危害以及危害的程度来共同决定。n 其中转基因逃逸的可能性是由花粉介导的转基因植物向受体植物群体(栽培稻物种或野生近缘种)进行基因漂移的频率来决定; 而危害性则是由转基因是否能在野生群体中发生遗传渐渗, 进而改变野生群体进化潜力和入侵能力来共同决定。 第6章 一、转基因生物风险评价：方法和案例1. 转基因生物的风险评价一般包括：1）科学性原则 实验设计、方法和手段以及结果分析客观严谨2）个案评估原则n 转基因生物的研发目的不同、生产方法、目的基因来源、功能，受体生物的生存环境都不完全相同，必须对每个产品个案在特定环境中产生的具体风险进行评估；3）逐步评估原则n 转基因开发的多个环节都要考虑，每一步都需要对中间产品的安全性进行相应的评价；4）熟悉性原则n 对转基因生物进行评价是，应尽量多的获取有关外源基因、常规亲本、转基因生物以及释放环境各个方面的知识；n 保证评价的完整性，也要考虑时间成本。5）实质等同原则n 根据转基因食品及同类传统食品两者的特性表现及成分进行分析比较2. 转基因风险评估一般包括以下内容：n 鉴别出可能产生负面作用的转基因生物的性状；n 评估每个负面作用的潜在后果；n 评估每个已经识别的潜在负面作用出现的可能性；n 评估已经识别的转基因生物性状可能构成的风险；n 对于转基因生物有意环境释放采取监管措施；n 判断转基因生物的整体风险。3.思考题n 防止抗性转基因生物（如Bt棉）中出现抗性有害群体的产生，可以为敏感害虫群体设置庇护所， 认识设置避难所的作用。二、转基因植物安全评价指南 （重点章节）看书本或PPT思考题：n 常用的转基因作物的检测方法包括哪些 ？理解检查目的？（1） 转录水平表达（RNA）：采用RTPCR或Northern杂交等方法，分析主要插入序列（如目的基因、标记基因等）的转录表达情况，包括表达的主要组织和器官（如根、茎、叶、种子等）。（2） 翻译水平表达（蛋白质）：采用ELISA或Western杂交等方法，分析主要插入序列（如目的基因、标记基因等）的蛋白质表达情况，包括表达的主要组织和器官（如根、茎、叶、种子等）。检查目的：从基因水平、转录水平和翻译水平，考察外源插入片段的整合和表达情况。n 对转基因生物中的转基因蛋白产物进行半定量分析常用方法？n 转基因生物在不同阶段具有不同的评价内容。简要介绍转基因作物风险评估几个主要阶段及其各阶段考察的主要目标有那些？ n 转基因生物安全评价是一个系统完整的评价体系。转基因植物安全评价的总体要求包括分子特征、遗传稳定性、环境安全、使用安全等几个方面，请就这几个方面的评价内容、评价（或检测）方法做详细论述