试验四-人毛囊DNA的快速提取及PCR检测性别M.ppt

实验四人毛囊DNA的快速提取及PCR方法检测SRY基因判断性别 实验目的 掌握毛囊DNA的快速提取方法及其原理掌握DNA的电泳检测技术学习PCR扩增DNA的原理 掌握PCR操作步骤掌握利用PCR技术扩增SRY基因判断性别的原理 试验内容 一毛囊DNA的快速提取与检测二PCR扩增进行性别鉴定 前期准备 前期处理 挑出毛发10根 尽量剪短至只剩下毛囊 去除毛根 放入干净的EP管中 加入PH8 0的灭菌水清洗1 2次 离心后吸出水 PCR扩增进行性别鉴定 PCR试验原理聚合酶链式反应 polymerasechainreaction PCR 是当今现代分子生物学的三大主流技术之一 PCR扩增产物检测 用浓度为1 2 的琼脂糖凝胶对PCR产物 DNA 进行电泳分离 琼脂糖凝胶中有很多小孔隙 起一个分子筛的作用 DNA在电场的作用下由负极往正极移动穿过这些孔隙 DNA迁移速率与电场强度成正比 与DNA分子量大小成反比 从而将大小不同的DNA片段分离开来 SRYPCR产物大小 501bpGAPDHPCR产物大小 565bp PCR扩增体系 10ul总体系 H2O7 10 70Buffer1 010Primer F0 33Primer R0 33dNTP0 33Taq0 11Template 毛囊DNA 1 0ul PCR扩增程序 95 4min 94 30s 60 30s 72 30s Goto230循环72 5min 4 5min 方法一酚仿抽提法 试剂 10 SDS 蛋白酶K 20mg ml 苯酚 氯仿 异戊醇 乙醇TE10mmol LTris Hcl PH 8 0 1mmol LEDTA PH 8 0步骤 酚仿抽提法 优缺点 该方法提取的DNA浓度不是很高 中间步骤过多会损失大量的DNA 所以如果是很细小的毛 并且量不多 不建议使用此方法 但是此方法提取的DNA质量较好 扩增效果好 酚仿抽提法 图1 酚仿抽提法检测结果 方法二 碱裂解法 于装有毛囊的EP管中加入0 2mol L的NaOH溶液50 L 煮沸15min后 瞬时离心 吸取上清液至另外一只干净的离心管中加入PH 6左右的Tris HCl50 L 13000r离心2min将上清液转移到另外一只EP管中即可 方法二 碱裂解法 优缺点 该方法提取步骤较简单 提取周期短 并且DNA损失量较少 提取效率高 但PH值不容易调节以至于会影响到后续PCR扩增 因此如果PCR扩增效率不高的引物 不建议用该方法提取 方法三 PCR扩增法 试剂 10 PCR缓冲液 Mg2 蛋白酶K 20mg ml 实验步骤 按以下体系配制毛囊裂解液 10 PCR缓冲液100 LMg2 80 L蛋白酶K 20mg ml 1 LddH2O819 L 方法三 PCR扩增法 加入上述裂解液15 L于放有毛囊的EP管中在PCR仪上设置一个单循环程序 65 30min 95 15min 4 10min 将上一步骤中的PCR试管放入预热好的PCR仪中 运行该程序 吸取上清液于干净的EP管中即可 方法三 PCR扩增法 优缺点 该方法提取DNA的效率较高 可获得较多的DNA 并且需要的毛囊量较少 较细且少量的毛囊建议用此方法提取DNA 但是该方法抽提的DNA质量不是很好 扩增的时候需加大DNA加入量 并且扩增的结果中可能会有大量杂带 图2 PCR法抽提检测结果 电泳检测 制备1 的琼脂糖凝胶进行电泳检测DNA具有结合EB分子的能力 在紫外灯下产生荧光的信号 二PCR扩增进行性别鉴定 性别鉴定原理人类男性的性染色体组成是XY 女性的性染色体组成是XX 因而通过对一些在Y染色体上所特有的基因 如SRY基因 进行PCR扩增分析 即可对性别进行鉴定 本试验通过对毛囊DNA中的SRY基因进行PCR扩增分析进行性别鉴定 扩增呈阳性