碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化.docx

实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化一、实验目的 学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。二、实验原理在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。三、实验材料大肠杆菌DH5（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）四、实验仪器、用具高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪五、实验试剂LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖抽提质粒DNA所需的溶液：溶液：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；溶液： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)，现配现用；溶液：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2；电泳缓冲液（0.5TBE）：45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0；六、实验步骤：1、质粒DNA的提取（1） 在LB固体平板上挑单菌落接入2ml 含Amp的LB液体培养基中（已灭菌），37振摇培养过夜；（已经完成）（2） 取1mL菌液放入Ep管中，12000 r/min（简写rpm）离心1min；弃尽上清；（3） 加入200L预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡混匀；（4） 加入200L的溶液，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌；（5） 加入200L的溶液，温和混匀，20放置8min；（6） 12000rpm离心5min；（7） 吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500L氯仿/异戊醇（V：V=24：1）充分混匀，12000rpm离心5min；（8） 小心移取上清液500L至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20静置10min，12000 rpm离心10min，弃上清；（静置期间安排制琼脂糖凝胶，每组制胶一块，具体见附件）（9） 加入200L70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干；（10） 加入20L RTE （含10g/mL RNaseA 的TE，pH8.0）溶解质粒DNA， 37放置10min。（11） 取45L质粒DNA溶液于另一干净离心管中，加入8L TE及2L上样缓冲液，混匀后全部点样于一个琼脂糖凝胶点样孔中。（12） 打开电源开关，调电压为80100伏进行电泳 (注意电泳方向！)。（13） 电泳约40分钟后关掉电源，把凝胶置于紫外仪上观察结果并记录。七、结果与分析根据实验得出的结果，分析并有关影响因素和实验过程中的注意事项。附：1琼脂糖凝胶的制作以制30mL量的琼脂糖凝胶为例，具体过程如下：1、称量0.3g的琼脂糖粉置于一干净的小三角瓶中；2、加入30mL 0.5TBE于三角瓶中，称出总重量并记录；3、在微波炉中充分溶解（约1分钟），称溶解后的总重量并用蒸馏水补充至原总重量（注意不要烫到手！）；4、室温条件下放置或自来水冲三角瓶下部到溶液温度冷却到约50度，此时再加入1.5L goldview染料(原则上按照100mL琼脂糖液加goldview染料3-5L)，混匀；5、把混合液倒入一已插入梳子的制胶模具中，让其自然充分凝固（一般需要20分钟以上）；6、小