粗蛋白的测定方法原理及操作探讨

粗蛋白的测定方法原理及操作探讨 中央化验室陆学文2012 02 15 蛋白质是含氮的有机化合物 在催化剂作用下 用硫酸破坏有机物 使含氮物转化成硫酸铵 加入强碱进行蒸馏使氨逸出 用硼酸吸收后 再用酸滴定 测出氮含量 将结果乘以换算系数6 25 计算出粗蛋白含量 1凯氏定氮仪原理 1 1消化 首先将含氮有机物与浓硫酸共热 经一系列的分解 碳化和氧化还原反应等复杂过程 最后有机氮转变为无机氮硫酸铵 这一过程称为有机物的消化 消化 蛋白质 H2SO4 NH4 2SO4 SO2 CO2 H2O 1 消化样品中的有机物和含N有机化合物 经浓H2SO4加热消化 H2SO4使有机物脱水 炭化为碳 碳将H2SO4还原为SO2 而本身则变为CO2 SO2使N还原为NH3 而本身则氧化为SO3 而消化过程中所生成的新生态氢 又加速了氨的形成 在反应中生成物CO2 H2O和SO2 SO3逸去 而NH3与H2SO4结合生成 NH4 2SO4留在消化液中 蛋白质 H2SO4 CC H2SO4 SO2 CO2 SO2 N NH3 SO3 NH3 H2SO4 NH4 2SO42CH3 CH COOH 13H2SO4 NH4 2SO4 6CO2 12SO2 16H2O NH2浓硫酸具有脱水性 使有机物脱水并炭化为碳 氢 氮 浓硫酸又有氧化性 使炭化后的碳氧化为二氧化碳 硫酸则被还原成二氧化硫 二氧化硫使氮还原为氨 本身则被氧化为三氧化硫 氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中 NH3 H2SO4 NH4 2SO4 消化完成后 取出放凉后加入约30mL蒸馏水 将消化液转入凯氏定氮仪反应室 加入过量的40 氢氧化钠溶液 将NH4 转变成NH3 通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内 硼酸接受氨后 形成四硼酸铵 然后用标准盐酸滴定 直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度 1 2蒸馏 蒸馏 NH4 2SO4 2NaOH Na2SO4 2H2O 2NH3 2NH3 4H3BO3 NH4 2B4O7 5H2O 1 3滴定 滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数 通过计算即可得出总氮量 在滴定过程中 滴定终点采用甲基红 次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定 测定出的含氮量是样品的总氮量 其中包括有机氮和无机氮 滴定 NH4 2B4O7 2HCl 5H2O 2NH4Cl 4H3BO3 总反应式如下 消化 蛋白质 H2SO4 NH4 2SO4 SO2 CO2 H2O蒸馏 NH4 2SO4 2NaOH Na2SO4 2H2O 2NH3 2NH3 4H3BO3 NH4 2B4O7 5H2O滴定 NH4 2B4O7 2HCl 5H2O 2NH4Cl 4H3BO3 蛋白质是一类复杂的含氮化合物 每种蛋白质都有其恒定的含氮量 约在14 18 平均为16 质量分数 凯氏定氮法测定出的含氮量 再乘以系数6 25 100 16 6 25 即为蛋白质含量 从总反应式中可以看出 滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数 1 例如 0 7g南美鱼粉 粗蛋白为65 消耗的盐酸摩尔数即为氨气的摩尔数 65 NHCl k m CHClV 8 75 0 7 当浓度为0 2mol L时 一般消耗盐酸的体积约为26mL NHCl NNH3 0 0052mol NH4 2SO4 2NaOH Na2SO4 2H2O 2NH3 220 0052mol0 0052mol即硫酸铵消耗VNaOH 0 0052mol 9 6mol L 0 000542L 0 542mL 2 0 4gCuSO4 5H2O中 硫酸铜的摩尔数为0 4 250 0 0016molCuSO4 2NaOH Cu OH 2 Na2SO4120 0016mol0 0032mol硫酸铜消耗VNaOH 0 0032mol 9 6mol L 0 33mL由此可见 硫酸铵和硫酸铜消耗的氢氧化钠的量较少 氢氧化钠主要是与硫酸发生中和反应 样品和试剂消耗氢氧化钠的量从总反应式中可以看出 滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数 消化中消耗硫酸的量 1 K2SO4 H2SO4 2KHSO42KHSO4 K2SO4 H2O SO3 116 174 0 03448mol0 03448mol硫酸钾消耗硫酸VH2SO4 0 03448mol 18 4mol L 1 87mL2 硫酸铜的作用机理如下所示 C 2CuSO4 加热 Cu2SO4 SO2 CO2 21Cu2SO4 2H2SO4 2CuSO4 2H2O SO2 122CuSO4 Cu2SO4 2H2SO4220 4 1600 0025mol硫酸铜消耗硫酸VH2SO4 0 0025mol 18 4mol L 0 14mL以下是仪器商提供消耗硫酸的量参考数据 3 1g样品消耗3 6 7mL4 蒸发损失1 2mL5 管内残留1 7 5 1mL 1 40 NaOH NaOH含量 96 以96 计 的摩尔浓度 40g 96 40g mol 0 1L 9 6mol L 2 浓H2SO4的摩尔浓度 18 4mol L 3 那么50mL40 NaOH溶液能与多少体积的浓硫酸反应 NaOH主要与 NH4 2SO4 硫酸铜 硫酸反应 而加入的碱量是固定的 50mL 因此当加入的酸过多时 酸就会消耗过多的碱 从而不能使 NH4 2SO4与碱充分反应 生成的氨气量减少 最后不能反映出实际的含氮量 在消化的过程中 硫酸也会有损失 但从主要反应中可以估算出加酸的量 不能多于13mLH2SO4 2NaOH Na2SO4 2H2O1218 4mol L V19 6mol L 50mLV1 13 04mL 浓硫酸的用量与40 NaOH溶液的关系 1 硫酸 化学纯 含量为98 无氮 2 混合催化剂 0 4gCuSO4 5H2O 6gK2SO4 均为化学纯 磨碎混匀 药品先过筛 后各称量 再混合 3 NaOH 40 水溶液 化学纯 4 硼酸 4 水溶液 化学纯 5 混合指示剂 甲基红 亚甲基蓝 2 1 配置浓度都为0 1 6 0 2mol LHCl标准溶液 7 蔗糖 分析纯 8 硫酸铵 分析纯 干燥 9 硼酸吸收液 2实验试剂 3仪器 实验用样品粉碎机或研钵 40目 0 45mm 分析筛 分析天平 消化装置 酸式滴定管 凯氏定氮蒸馏装置 4操作步骤 磨样 称样 加入催化剂和浓硫酸 消化 蒸馏 滴定 4 1磨样 确保样品均匀 颗粒细度 1mm 4 2称样 用差量法称取试样0 5 1g 含氮量5 80mg 准确至0 0002g 小心无损的将样本放入洗净烘干的凯氏消化管中 加减样时要细心 不能抖动样匙 否则会引起样品的自动分级 使加入的硬质部分多 粉末部分少 造成实验不精确 样品放入消化管内时 尽量不要沾附管壁上 万一沾附可用少量水冲下 以免被检样消化不完全 结果偏低 加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点 硫酸铜为催化剂 硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂 加浓硫酸要沿着消化管口缓慢加入 同时轻轻转动消化管 使散落在管口处的样品接触到硫酸并被碳化 有利于样品的完全消煮 如硫酸缺少 过多的硫酸钾会引起氨的损失 这样会形成硫酸氢钾 而不与氨作用 因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时 要增加硫酸的量 4 3加入催化剂和浓硫酸加入6 4g混合催化剂与试样混合均匀 再加入12mL浓硫酸 消化时如不容易呈透明溶液 可将消化管放冷后 慢慢加入30 过氧化氢2 3ml 促使氧化 4 4消化 420 2h 直至呈透明的蓝绿色 消煮时间不能过短 要达2h以上 否则样品消煮不完全 也会造成很大的实验误差 开始消化时 当有白烟 SO2 产生后 先把抽气的水流量满负荷开大 十分钟后再调小 调小量以烟雾能留在消化管内而又不冷凝成滴为宜 以免使硫酸损失过大 4 5蒸馏 向蒸馏瓶中加入浓碱时 往往出现褐色沉淀物 这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应 生成氢氧化铜 蓝色 经加热后又分解生成氧化铜的沉淀 黑色 有时铜离子与氨作用 生成深兰色的结合物 Cu NH3 4 CuSO4 2NaOH Cu OH 2 Na2SO4氢氧化铜蓝色沉淀Cu OH 2 CuO H2O氧化铜黑色的沉淀2CuO H2O CO2 Cu2 OH 2CO3碱式碳酸铜墨绿色黑色的沉淀有可能是Cu2 OH 2CO3和CuO 蒸馏时间以流出的液体呈中性为宜 可用pH试纸测试 4 6滴定 滴定终点的判断准确的滴定终点判断是保证检测结果准确的一个关键 在判断终点时 要敏锐地把握溶液临界颜色的变化 甲基红 亚甲基蓝混合指示剂在碱性溶液中呈绿色 在中性溶液中呈灰色 在酸性溶液中呈红色 用标准盐酸溶液滴定时 溶液由蓝绿色变成灰红色为终点 滴定浓度盐酸标准溶液浓度必须精确适中 不宜过高也不宜过低 浓度过高 加大滴定终点的控制难度 过低 滴定消耗的盐酸量过大 4 6 1混合指示剂变色范围 甲基红 次甲基蓝变色点pH 5 4 5 2 红紫 5 4 灰蓝 5 6 绿 保存于棕色瓶中 甲基红 溴甲酚绿变色点PH 5 1pH5 0以下为暗红色 pH5 1为灰绿色 pH5 2以上为绿色 在酸中酒红色 碱性为绿色 做粗蛋白时是由蓝绿色变成灰红色 4 6 2混合指示剂变色原理 当溶液PH值发生变化时 指示剂可能失去质子由酸色成分变为碱色成分 也可能得到质子由碱色成分变为酸色成分 在转变过程中 由于指示剂本身结构的改变 从而引起溶液颜色的变化 指示剂的酸色成分或碱色成分是一对共轭酸碱 酸式色碱式色 H H 蒸馏步骤的检验精确称取0 2g硫酸铵代替试样 按相同蒸馏步骤进行操作 测得硫酸铵含氮量为21 19 0 2 否则应检查加碱 蒸馏和滴定各步骤是否正确 6空白测定称取蔗糖0 5g 代替试样 进行空白