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隐孢子虫病的诊断及治疗2014-12-11 10:58 来源：丁香园 作者：sunnymercy 字体大小 - | + 隐孢子虫是水源性传染病和免疫功能低下患者出现腹泻疾病的主要病原体之一，同时其也可导致儿童出现营养不良等并发症。但目前在隐孢子虫病的诊断、治疗和免疫接种等方面仍存在知识空白。美国的Checkley等人对隐孢子虫病的诊断和治疗进行了回顾，全文发表在2014年9月30的Lancet Infect Dis杂志上。现将全文编译如下。一、前言隐孢子虫于1976年被确定为可导致人类感染的一种病原体。80年代初，隐孢子虫被认为是AIDS患者慢性腹泻的一个主要病因，通过动物及水源传播，同时也是儿童腹泻的原因之一。90年代中期，研究发现隐孢子虫普遍存在，并且与儿童营养不良及医疗资源匮乏地区的早产儿死亡有关。1993年，美国密尔沃基一次大规模的水源性传染病感染超过40000人。尽管已知道这些相关知识，但是对隐孢子虫的认识仍不够全面、诊断力度不足，治疗不满意，预防措施不完善。即使是像美国这样现代诊断技术广泛应用的国家，诊断并报道的隐孢子虫病例估计也仅有1%。最新的知识进展正在改变人们对隐孢子虫病的流行病学观点，同时隐孢子虫的全球疾病负担也在增加。为识别隐孢子虫病研究的知识空白和未来的新研究机遇，美国国立卫生研究院召集了一组专家来对隐孢子虫的流行病学、诊断、治疗和免疫接种等方面的进展进行了讨论。本篇综述对此次会议的讨论内容进行了总结，并对已公布的研究提供一个更深入的回顾分析。二、隐孢子虫的流行病学1、疾病负担隐孢子虫属于原生动物界隐孢子虫属，在全球广泛分布。早期研究表明，隐孢子虫存在于高收入国家具有免疫功能宿主的1%粪便中，而在低收入地区，隐孢子虫出现在5-10%的宿主粪便中。最近使用PCR和抗原检测进行的研究表明，早期研究低估了隐孢子虫的感染频率，它仅在15-25%的腹泻儿童中检测出隐孢子虫。隐孢子虫病与持续较长时间的腹泻和较高的儿童发病率和死亡率相关，尤其与长期腹泻（7-14天）和持续腹泻（14天）相关。在乌干达进行的横断面研究表明，伴有隐孢子虫感染的儿童腹泻疾病其死亡率高于无隐孢子虫感染患者。队列研究也表明年龄越小，其感染的风险越高。例如，在印度进行的一个多中心儿童（小于5岁）研究发现，75%的病例是出现在小于2岁的儿童患者中。许多研究表明，隐孢子虫感染与儿童营养不良和生长缺陷相关。秘鲁的一个儿童队列研究发现，即使是无症状感染也与生长缓慢相关。症状性感染其阻碍体重增加的程度要高于无症状性感染，但是无症状性感染是普通感染的两倍，也许还对儿童的生长发育有更严重的总体不良作用。全球肠道多中心研究，一个旨在评估南亚及撒哈拉沙漠以南7个地区的中至重度腹泻儿童患者的病因、疾病负担、临床症状和不良预后的研究发现，在所有地点的患者刚出生的两年里，隐孢子虫为中至重度腹泻的四个主要原因之一。在年龄小于2岁的中至重度腹泻儿童患者中，隐孢子虫是仅次于轮状病毒的第二个病因。在对入组患者进行2-3个月的随访发现，年龄处于12-23个月的中至重度隐孢子虫感染患者其死亡风险是无腹泻对照组的2-3倍。2、微生物学应用分子生物学方法可对隐孢子虫属的特征进行区分，这不同于流行病学。虽然已注意到人类的隐孢子虫感染超过15种，但是全球大部分感染为专性感染人类（C hominis）和除感染人类外还感染其他动物（C parvum）的微小隐孢子虫。这两种类型的微小隐孢子虫的基因组序列在CryptoDB上可获得的。在秘鲁、巴西、孟加拉和印度的研究中，C hominis是引起儿童腹泻的主要病原体。英国的一个研究发现，C parvum更常见于农村人口，与动物暴露相关，在春天达到发病高峰，而C hominis更常见于城市，与幼小儿童相关，在夏末和秋天达到发病高峰。在秘鲁，所感染的隐孢子虫种类与感染的年龄、社会经济状况和营养状况无关。C hominis，尤其是Ib亚型，与更多的卵囊脱落和恶心、呕吐、全身不适等症状相关。3、风险因素与隐孢子虫感染相关的环境因素也需要进一步了解。印度的一个纵向研究发现，对那些居住在家庭中的儿童，不管是使用瓶装水还是市政饮用水其隐孢子虫发病率是一样高，这表明大部分的隐孢子虫传播并不涉及饮用水。季节性的发病模式也可能与传播风险增高有关。在肯尼亚，研究者发现在雨季结束和旱季开始时，地表水中的卵囊数量要比其他时间点的要多，这与东非人类隐孢子虫病的季节性发病高峰相一致。对隐孢子虫季节性影响进行验证的Meta分析发现，周围环境温度较高（在温带国家更重要）和降雨量较多（在热带地区更重要）与隐孢子虫病发病风险增高相关。乌干达的一个研究发现，有免疫功能的儿童存在呼吸道传播的可能。儿童早期营养不良也增加隐孢子虫感染性腹泻的风险。孟加拉国一个出生队列研究发现，出生时生长迟缓与后续的隐孢子虫感染相关。一个纵向研究发现，感染前体重年龄Z分数大于-1SD但小于平均数（如HAZ分数96%），对gp60进行测序已经用于隐孢子虫的亚分型。多基因座方法也是合适的，但是尚未标准化。在DNA提取前通过玻珠击打法、冻融法、煮沸法或者化学裂解法破坏卵囊是有必要的。但是，使用简单方法来提取DNA的快速分子检测方法已经在研发中。对肠道病原体进行的多重分子诊断方法发现多重感染常见于资源匮乏地区的腹泻患者和健康对照组。部分数据表明，隐孢子虫的定量可能与疾病的严重程度相关，因此定量方法对未来的研究和药物方案的评价起重要作用。在隐孢子虫的流行病学研究中，血清学检测是一个重要工具，因为在症状性和无症状性感染后患者出现特异性的抗体应答。但是，IgA反应常常持续时间较短，而IgG反应可持续存在数月。针对Cp23的抗体似乎与既往感染相关，而Cp17反应（也称为gp15）意味着近期感染，P2反应与重复感染相关。这些方法，均适应路明克斯公司的血清诊断平台，可通过收集滤纸上的指尖血或者口腔里的液体进行。表1 隐孢子虫的诊断方法优势缺点显微镜技术简单、应用广泛敏感性低（改良型抗酸染色法敏感性约为70-80%）抗原检测敏感性好（70-100%）；数种商业盒子可用，包括酶免疫方法、免疫荧光方法和免疫色谱技术对资源匮乏国家来说比较昂贵核酸扩增敏感性极高；可分类、分型和定量；对其他的肠道病原体目标可经得起多种测试设备昂贵；有技术要求，需要熟练的实验室人员进行DNA提取及扩增血清学方法用于监测和区别既往感染、近期感染和重复感染仅限于研究实验室使用四、治疗抗寄生虫药治疗隐孢子虫感染是次优治疗。对免疫缺陷患者，改善细胞免疫功能是治疗隐孢子虫的一个重要先决条件（例如，对患有AIDS的隐孢子虫患者给予组合抗逆转录病毒治疗）。但是，在初次治疗中出现了大量的死亡病例。在体外、动物模型和病人中具有抗隐孢子虫活性的药物在表2中有详细介绍。螺旋霉素、阿奇霉素和免疫球蛋白在伴有AIDS的隐孢子虫患者的对照试验中无效。巴龙霉素的两个随机、安慰剂对照试验发现，巴龙霉素对隐孢子虫病的症状和卵囊脱落效应较小，但是小样本无法得出确定性的结论。硝唑尼特是FDA批准的用于治疗隐孢子虫病的药物。随机研究发现，使用硝唑尼特治疗无HIV的成人和儿童患者有有益的效应，且在营养不良儿童中其死亡率明显下降。但是，腹泻症状消失仅在56%接受硝唑尼特治疗的患者中出现，而安慰剂治疗组中有23%。而且，在伴有HIV但无有效抗逆转录病毒患者中进行的三个研究并未发现硝唑尼特治疗对总体效果有改善。体外和动物研究发现药物联合治疗可能有部分作用。在对合并有HIV或AIDS的患者的诊治中，临床医生应考虑给予症状性治疗，优化抗逆转录病毒治疗，或者纳入硝唑尼特和巴龙霉素治疗。C hominis、C parvum和其他类型的隐孢子虫的基因组序列和功能性基因数据的获得为研究提供了新的研究工具，可探索独特的代谢路径并将其作为化学疗法的靶点。例如，钙依赖的蛋白激酶是植物和一些顶覆虫寄生虫的酶的保守家族，后者包括隐孢子虫。结构分析表明顶覆虫钙依赖蛋白激酶有作为ATP结合位点看门残基的甘氨酸，这形成了一个疏水区，使得抑制剂更容易抑制人类细胞系和SCID/beige小鼠中的C parvum。微管构造是另一个潜在的药物靶点。硝基苯胺，包括氟乐灵，是在体内外可封闭微管构造和抑制隐孢子虫生长的除草剂。而且，基于阿苯达唑和氟乐灵的杂化混合物的发展可在体外有效识别类似物，并且使得小鼠的卵囊脱落降低79-81%。隐孢子虫从头合成营养素的能力较差，包括氨基酸、核苷酸和脂肪酸。许多与代谢相关的基因已经丢失，包括顶质体通路、线粒体呼吸链和次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟氨酸磷酸核糖转移酶。隐孢子虫依赖糖酵解产生ATP、乳酸、乙醇和醋酸终端产物。因此，抑制己糖激酶和乳酸脱氢酶的抑制剂有一些作用。此外，涉及脂肪酸代谢的几个蛋白已在空泡膜上发现。例如，Triacsin C和其他药物抑制脂肪酰基辅酶A结合蛋白和脂肪酸辅酶A合成酶，并在体外和小鼠中减少C parvum的卵囊产生。一种寄生虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂在体外和动物模型中也有效。分子生物学证据表明，来自于细菌的基因水平转移为隐孢子虫化学治疗提供了潜在的靶点。肌苷单磷酸对黄嘌呤核苷单磷酸的催化作用是通过肌苷-5-单磷酸脱氢酶（IMPDH）起作用的，这在鸟嘌呤核苷酸合成中是一个关键的限速步骤。与其他顶覆虫相反，隐孢子虫IMPDH基因是原核的。高通量筛查通过靶向高度相异的辅因子结合位点来识别可能的隐孢子虫IMPDH的选择性抑制剂。后续的优化中出现了单位数毫微摩尔抑制剂，其有六种不同的架构，对隐孢子虫IMPDH的选择性大于10-3倍。在敲除白介素-12的隐孢子虫小鼠模型中两种复合物联合用药降低了卵囊脱落。其中一种复合物以多剂量方案给药时其疗效超过巴龙霉素。进一步的可能研究方向包括确保肠道中药物浓度增加，以及改善动物模型来研究潜在复合物的疗效。药物再利用是已批准药物的一种新型用法。基于细胞的筛查方法及后续的体外优先方向方法已经完成。自动成像和图像分析用于识别未来体外研究的可能的体外方向。对727种复合物筛查后得出16种确定的选择性抑制剂，包括针对宿主酶的HMG-CoA还原酶抑制剂。对伴或不伴低剂量硝唑尼特的协同药物组合治疗的进一步筛查正在进行中。表2 隐孢子虫病的化学疗法药物批准情况限制硝唑尼特已批准用于隐孢子虫病的治疗，但是不用于合并HIV的感染在健康患者中有效性为56-96%；在晚期AIDS患者中无效；花费高且在广泛使用上受限制巴龙霉素已批准用于其他适应症在AIDS患者中疗效有限；无其他组别的对照数据阿奇霉素已批准用于其他适应症在晚期AIDS患者中无效；在AIDS患者中与其他药物联合治疗疗效不详利福昔明已批准用于其他适应症在鸟结核分枝杆菌预防的研究中对预防隐孢子虫病感染有效HIV 蛋白酶抑制剂已批准用于HIV治疗与HIV患者中隐孢子虫病的缓解有关；在小鼠模型中对隐孢子虫有部分疗效五、免疫反应和疫苗发展几种类型的证据表明研发预防隐孢子虫感染的疫苗是可行的，包括：免疫缺陷患者的易感性和疾病严重程度增加；高流行区的成人对再次感染有部分免疫；以及人类试验性研究发现既往感染或暴露导致感染剂量更高。但是，有效疫苗所必须的保护性免疫应答未完全了解。人类清除感染和预防再次感染的免疫反应似乎涉及不同的固有免疫和适应性免疫机制。固有免疫反应是必要的，在激活适应性免疫系统时可提高早期应答。甘露糖结合凝集素在固有应答中占据重要位置。伴有甘露糖结合凝集素缺陷的儿童及感染HIV的成人患者其对隐孢子虫感染的易感性增高，且疾病更严重。甘露糖结合凝集素基因的多态性与隐孢子虫感染强烈相关，尤其是在复发性感染中。甘露糖结合凝集素也许能激活补体以调节寄生虫的清除。宿主细胞表面的Toll样受体触发对微生物的重要应答。C parvum感染增加抗微生物多肽的产生（LL-37和人-防御素2）。体内外研究表明敲除TLR/MyD88基因导致防御素产生减少且寄生虫负担加大。体内研究发现肠腔中存在外来体，且携带有来自于上皮表面的抗微生物多肽的外来体有助于清除隐孢子虫。MicroRNAs在转录后调节和调节固有免疫对隐孢子虫的免疫应答中有重要作用。例如，miRNA表达的变异与C parvum疾病的改变有关。自然杀伤细胞在部分小鼠模型中有助于清除感染。在小鼠中，干扰素对固有免疫和获得性免疫应答有重要作用。相反地，在既往未感染过的宿主中人类感染与白介素15的产生相关，而后者可在体外激活自然杀伤细胞清除感染。在其他模型中，巨噬细胞似乎对固有宿主应答有重要作用。CD154-CD40配体受体对也在清除感染中起重要作用。伴有胆汁阻塞的重症、慢性感染在人高-IgM综合征中常见，并与CD40配体的突变相关。CD4细胞在人类和动物的获得性免疫应答中均起关键作用。一个纵向研究发现，相较于未感染的儿童，感染了隐孢子虫的儿童更容易携带HLA II 类DQB1*0301等位基因（提呈抗原至CD4细胞）和HLA I类 B*15 等位基因（提呈抗原至CD8细胞）。对合并AIDS患者，其感染的风险和严重程度与CD4细胞数相关。干扰素与人类的获得性免疫相关，而干扰素基因敲除小鼠对感染的易感性增高。干扰素治疗降低细胞系对感染的易感性，但原代上皮细胞并不降低CD8细胞协助清除人类感染。体液免疫在保护人体免受隐孢子虫侵袭中的作用尚未清楚。在小鼠模型中，超免疫球蛋白控制感染，但是清除细胞并无明显影响。分泌性IgA对健康志愿者或合并AIDS的患者无保护作用。相反，特异性抗体与孟加拉国儿童发病时间短高度相关。类似的，母乳中的隐孢子虫抗体对母乳喂养婴儿起免疫保护作用。针对寄生虫表面抗原gp15/17的抗体保护患者免受再次感染；但是，这一抗体也可是强烈细胞免疫应答的一个标志。因此在隐孢子虫病中无明确的保护性免疫的替代标志存在。目前已经探索出几种用于疫苗的抗原。无菌猪的研究发现C parvum和C hominis之间存在不完整的交叉保护。类似的，在资源匮乏国家儿童中进行的队列研究发现存在频繁的再感染。再感染很可能是由不同种类和亚型的隐孢子虫引起，但是也存在由相同亚型引起的再感染病例。作为疫苗候选的几种抗原已经在研发中。例如，gp60（也称为gp40/15）是一种多聚蛋白，由寄生虫丝氨酸蛋白酶裂解成两种表面蛋白-gp15和gp40，后者多变，用于物种形成和基因分型。Gp15和gp40均可以通过那些既往感染患者的外周血单核细胞刺激干扰素产生。在孟加拉国的儿童中，针对gp15的IgA抗体并非种类特异性，且与疾病持续时间较短相关。仅以gp15为基础或和其它抗原组合的疫苗正在研发中。包含有称为Cp15的二级15 kDa大小抗原的重组性DNA疫苗具有免疫原性，对怀孕的山羊进行免疫接种可保护其后代。已有研究在减毒沙门氏菌、重组疫苗和DNA载体上表达该抗原。在沙门氏菌载体上携带有Cp15的疫苗可保护小鼠免受感染，但是这一保护效应并不明显优于仅用载体。孟加拉国的一个研究发现，感染患者其针对Cp23的血清IgG、IgM和IgA高于健康患者的，且再次应答在几种亚型中是保守的，并与疾病发病时间较短相关。动物研究表明，Cp23质粒可促进抗体和CD4的激活，降低寄生性疾病、保持对寄生虫的长期免疫力。其它疫苗载体包括表达DNA、乳酸杆菌和表达Cp23的沙门氏菌。其它正在研发中的用于疫苗的抗原包括P2抗原、抑制蛋白、隐孢子虫三磷酸腺苷双磷酸酶、Muc4和Muc5。六、讨论越来越多的证据表明隐孢子虫的全球负担在增加，尤其是在儿童和免疫缺陷或营养不良的人群中。在本篇文章中作者强调了隐孢子虫作为重要的儿童腹泻病原体但被过于忽视的尴尬地位。而且，全球多中心肠道研究的结果发现隐孢子虫感染与亚急性死亡有关系。需要进行更详细的研究来阐释隐孢子虫感染造成损伤的机制和其健康影响。使用先进的分子生物学方法进行纵向研究对阐释感染的发病机制、宿主和环境因素在易感性、免疫应答和临床预后中的作用有关键作用。有必要对隐孢子虫感染的全球变异和在社区环境中的影响进行更好的描述。目前对不同隐孢子虫基因型对疾病和生长发育的影响了解不多，这需要更好的定义。同时需要更好的方法来定义基因型，以提高对寄生虫种类的了解。最后，虽然无症状性隐孢子虫感染与特定地区研究的发育不良相关，但是仍需要有设计良好的纵向研究来提高我们对无症状性感染在生长和发育中的位置和不良影响的了解。在资源匮乏地区快速诊断隐孢子虫感染具有挑战性。如何解释儿童腹泻患者中的多重肠道病原体尚未清楚。显微镜和抗原检测方法对在种属水平上进行临床诊断有益。种类辨别和基因分型对疾病爆发的调查、流行病学、疾病负担评估和风险因素和传播研究有重要作用，最终可能有助于确定临床诊断。隐孢子虫的种类和亚型信息对临床护理和治疗选择并非必须的，但是在药物调查和临床试验中可能需要考虑。新型的粪便诊断技术、血清诊断技术和隐孢子虫病生物标志比现今的诊断方法更准确的辨别活性隐孢子虫感染，这可用于准确的病例诊断、治疗和疫苗试验。研发治疗隐孢子虫病的药物存在许多困难，包括如何在体外繁殖这些微生物。新型的体外方法可确保隐孢子虫繁殖，并可能有助于改善体外筛查新型治疗和疫苗。用于药物评估的动物模型缺乏标准化，且与人群中反应相关的目标反应未清晰定义。无菌小猪和免疫抑制沙鼠是仅有的可用于C hominis的动物模型，虽然两者均未广泛采用。虽然C parvum