Agilent LC色谱及色谱柱疑难解答.doc

Agilent LC色谱及色谱柱疑难解答出现倒峰的原因：1.常为溶剂峰,流动相的紫外吸收大于样品的溶剂的紫外吸收,就产生倒峰.2.样品中的杂质没有紫处吸收或吸收很小,而流动相紫外吸收大,如用甲醇时波长设定在220nm以下时,常出现这种现象.3.进样过程中进入了空气也会导致的.4.如果流动相有紫外吸收的杂质，使用紫外检测器时，会产生倒峰，必须用高纯度的溶剂作为流动相。5.检测器的极性接反了，也会出现倒峰。第一，用的是什么检测器？如果是示差折光，那很正常；第二，倒峰在什么位置？如果是溶剂峰，也很正常，要去除的话，溶剂改用流动相；第三，如果是紫外检测器（MWD,OR DAD）,有没有加参比波长？如果有，去掉参比波长或另选合适的参比波长；第四，如果是紫外检测器，流量池里是否有气泡产生？1.抽滤或超声去除流动相里的气泡；2.检查在线脱气机（如果有的话）；3.调节背压；第五，流动相是否在该波长（用紫外检测器的话）有较大的背景？1.检查你用的溶剂的等级；2.检查色谱条件的合理性。我认为是参比波长设置的问题，试着换个参比波长看看 多半是因为样品的值与流动相的值不一致造成的，解决办法：加大盐的浓度，用流动相溶解样品即可流动相背景吸收波长低于检测波长1. 组分的吸收小于流动相的背景吸收，可能原因是流动相中加入截止波长较大的成分或波长选择不合适2.二极管阵列检测器中参比波长处吸收大于组分吸收；、 首先确定是还是柱还是检测器的问题：换下柱看是否仍存在倒峰，如果不行再换检测器，以确定是否检测器或者柱的问题。或者什么都不要换单纯换个其他化学成分，看是否是因为你的样品存在问题。2、如果都做了，还是不行，就考虑是否流动相问题，一般DAD存在有规律倒峰的现象还真的不是很好解释，看您意思好象是倒峰只是跟着你的主成分走，这样你可以首先进个空白溶剂样品，看是否还有倒峰存在，如果空白样品没有倒峰那么就是你样品问题，是否你样品处理的有问题，一般液相对流动相的PH控制在大概2.5-7.5范围，如果过酸或过碱会导致填料被破坏引起成分在柱上的洗拖保留发生变化而导致规律倒峰出现也有可能，测下您的流动相PH以保证这个没问题。样品中残留的一点酸或碱应该没问题，因为酸碱在柱上基本没有保留，且量小应该没影响倒峰的出现，我个人认为是色谱柱的残余硅羟基所致，同一个色谱条件，我曾经分别用非端基封尾柱和端基封尾柱考察，前者即便是进流动相也会出现负峰，后者则没有，推断应为残余硅羟基对进样样品中的部分离子造成吸附，使进样部分的液体与流动相产生差异，由于溶质离子经过检测器时，紫外吸收信号减小，所以形成负方向的色谱峰。1.样品引入2.样品与流动相反应所致3.检测条件不合适,建议换二极管阵列查找4.外部引入的污染 最后一点几率很小,但也会存在的,就是仪器设备的系统误差 如何避免基线飘移？基线向上飘移表明系统中有污染。请冲洗色谱柱，净化样品，然后使用新溶剂。 向下飘移通常是由于检测室或柱箱中的温度波动的原因。减小室温变化，将仪器从通风橱中取出，并将色谱柱和毛细管保温隔热。向下飘移也可能由于溶剂的纯度不是 HPLC 级别的溶剂而且此纯度低的溶剂在紫外有吸收。 如何减少基线噪音？无规律噪音可能与污染有关。请冲洗色谱柱，对样品做合适的前处理以避免污染，并使用 HPLC 级别的溶剂。 连续噪音有可能由检测器或泵造成。要确定问题是否发生在检测器还是在泵，请先关泵停掉流量，监测基线。如果此时基线平稳，则噪音可能与泵有关系。使用 ChemStation 在线诊断或 LC 手持控制器检查泵方面的故障。如果停泵后噪音继续存在，则说明噪音与检测器有关。首先，请尝试更换灯。如果问题依然存在，则请与安捷伦科技公司联系。在中国，请拨打 800 820 3278。 什么原因导致基线毛刺？这很有可能是流动池内有气泡。请先停泵来进行确认,如果毛剌消失，则很有可能是由于流动池内有气泡。需要冲洗流动池。如果毛剌仍然存在，则需检查检测器本身的电噪音有关。如果需要更多帮助，则请致电安捷伦科技公司。在中国，请拨打 800 820 3278。 什么原因导致基线波动？基线波动有可能与实验室的温度及湿度变化有关系。需确保室温及湿度稳定，将仪器从通风橱中取出，并将色谱柱和毛细管进行隔热保温。 我的色谱图上的峰有拖尾现象。如何改善峰形？可能的原因： 1. 系统内的死体积大2. 样品在色谱柱上有吸附3. 色谱柱适用时间很长 建议用户： 1. 尽量减少流动相管线的死体积，确保管线接头的连接合适减小死体积，由于不同生产厂家的管线的接头和密封垫圈有可能不一样，尽量使用安捷伦公司的管线接头和密封垫圈。2. 使用洗脱更强的流动相 3. 更换新色谱柱 如何排除流动相中的气泡？如何排出流动池中的气泡？避免流动相中产生气泡的最佳方式是将流动相经脱气装置进行脱气。如果没有脱气装置，则可以在流动相溶剂瓶中通入氦气进行脱气。也可以在检测器的出口端加一根细管线以调节流动池中的背压，但必须注意不要超过流动池的最大压力，否则会造成流动池漏液或流动池损坏。 如果流动池中出现气泡，则先摘下色谱柱，用一根管线直接将流动相接入检测器的入口。将异丙醇以较大的流速注入流动池。 直到基线上看不到毛刺为止。气泡就应该清除掉了。 把甲苯（toluene）用作衡量GPC色谱柱效率的标准是否恰当？是的，比较恰当。如果选择这种评估标准，小分子甲苯不会与填料发生相互作用，但是会扩散到GPC色谱柱填料的所有细孔中。通过这种实验，能够通过洗脱峰宽度评定填料微粒大小以及柱床填充效果如何。 这些是衡量效率时需要了解的内容。 大多数制造商通常推荐用这个样品来实验这些色谱柱的效率。 还能通过其它标准来确定GPC色谱柱的其它特征，例如排斥体积。 HPLC 色谱中的峰板（peak plate）有什么作用？这些峰板（peak plate）可以让您比较不同色谱柱的效率，衡量方法是对比色谱图中的峰宽和保留的峰宽。 一般而言，对于相同的保留时间，峰越窄，色谱柱的效率越高，效率越高，色谱柱就有越多的峰板（peak plate）。 HPLC 仪器一般通过测量峰宽（通常是半高）来确定色谱板或效率，采用的公式如下：N = efficiency = plates = 5.54(tR/w1/2)2 w1/2 = peak width at half-height in min.tR = retention time in min.色谱柱制造商会提供色谱柱的效率，通常包含在色谱柱报告中。 有关色谱板和色谱柱效率与分离度和被分析物之间关系的详细讨论，请参考文本 Practical HPLC Method Development（微粒HPLC方法开发），作者是Lloyd R. Snyder、Joseph J. Kirkland和 Joseph L. Glajch， Wiley-Interscience ，第二版，1997年。 HPLC中为什么会出现有节奏的波浪状基线？这通常不是色谱柱的问题。 最可能的原因是泵系统出了故障。a) 如果您有一个等度泵，那么泵密封圈可能已磨损。 通常您的泵会有两个活塞和密封圈。 其中一个密封圈可能比另一个磨损得更厉害，这会导致流速和压力发生非常有节奏的变化，检测器同样能看到这个变化。 通过改变流速，可以确认泵密封圈是否已磨损。 如果泵密封圈已磨损，基线波动频率（以时间为单位）会与流速的增加/降低成比例。 解决方法就是更换泵密封圈。b) 如果您有多个泵系统（二元、三元或者四元），那么可能是泵密封圈出了问题，但也可能是混合不充分或比例阀出了故障。 增加一根混合色谱柱可以解决混合不充分的问题（让制造商提供建议）， 比例阀出故障的话就呼叫维修中心。另一个可能的原因就是泵老化，尽管这些信号波动的周期性并不足以证明泵出了故障。 通过上面介绍的流速实验可以确认是否泵出现故障。 如果流速变化时，信号波动频率（以时间为单位）没有发生变化，那么可能是泵出了故障。 什么时候会看到伸舌峰（peak fronting）？ 如何排除故障？伸舌峰（peak fronting）可能由多种情况引起。 最有可能导致伸舌峰（peak fronting）的情况是色谱柱过载。 在这种情况下，通常会发现峰保留时间稍稍缩短。 这也是最简单的检查方法，因为只要注射少量样品并检查峰形就能发现问题。但是至少还有其它四种原因导致伸舌峰（peak fronting）。 这四种原因分别是色谱柱沟流、被分析物和硅之间的离子干扰、被分析物在流动相中溶解性差以及流动相和键合相之间的湿润性问题。 色谱柱沟流会导致所有的峰都变为伸舌峰（peak fronting），或者至少让色谱图中最大的峰变成伸舌峰（peak fronting）（如果其它峰过于小的话）。 如果出现这种问题，需要更换色谱柱。 用一根新色谱柱来研究这个问题。增加缓冲液离子强度或者改变流动相的pH值，通常能改善引发伸舌峰（peak fronting）的离子相互作用。 增加离子强度能够降低硅和离子被分析物之间的相互作用，而改变pH值能起到同样的效果。需要评定溶解性，尽力提高被分析物的溶解性并评估最后的色谱图。 例如，可以增加样品的声处理时间并把它重新注入或者让它溶解在溶剂中（在该溶剂中样品具有很好的溶解性），然后稀释并注入流动相。 此外，所有怀疑出现溶解性问题的样品都应进行过滤。 还可以通过脱机方式混合样品和流动相，观察在流动相中是否明显溶解。湿润性是指流动相完全渗透键合相的能力，在这种情况下，被分析物能与所有的键合相发生相互作用。 如果C18色谱柱结合使用高度水性的流动相，可能不会到达完全的湿润性。 键合相会自己折叠起来。 结果就可能会丢失保留时间并导致峰变形。 如果可能的话，增加流动相中的有机量并重新评估峰形。 否则，您可能需要考虑选择专门为极高水性流动相而设计的色谱柱。这些是导致伸舌峰（peak fronting）的主要原因及其解决方法。 请注意，这些问题可能会导致峰拖尾，解决方法与伸舌峰（peak fronting）的解决方法相同。 HPLC样品过滤得最好的膜过滤器是什么?再生纤维素 过滤器时推荐的HPLC样品过滤器，因为这种过滤器提供能防止样品过滤问题的单一、近乎通用的膜过滤方法.安捷伦的再生纤维素注射器过滤器产品有如下很多优点1.是化学惰性和化学稳定性高的过滤器，提供改善的流速和最大的回收率.2. 提供一种类型的过滤器取代多种滤膜的方法效率不降低.3. 对于生物样品，在流行的示售膜中安捷伦的膜过滤器具有最低的蛋白键合性能.4. 经过HPLC分析验证，具有低的可萃取性，包含一份分析证明. 如何选择液相色谱保护柱？保护柱的作用是用来防止分析柱被一些微粒物质堵塞,及在色谱柱上强吸附组分在色谱柱上吸附。为防止样品的杂质不进入色谱分析柱,不出现不必要的峰展宽，保护柱与分析柱的体积比应在 1:15 至 1:25 之间。 在理想的情况下，保护柱的填料应与分析柱相同，以确保得到分析柱较好的色谱图。尽量使保护柱与分析柱近似。在我们的目录里，将分析柱和与其配套的保护柱列在一起。 色谱图上出现鬼峰。如何消除？可能的原因： 1. 上次进样遗留组分产生2. 有污染3. 有气泡4. 色谱柱问题5. 保护柱失效建议用户： 1. 做样品后应保证有足够时间冲洗色谱柱,。有必要的话在运行结束后使用更强溶剂冲洗色谱柱。2. 洗脱原色谱柱中的原有污染。3. 为确保系统中没有气泡，只使用彻底脱气后的溶剂。4. 更换色谱柱。5. 更换保护柱。6. 检查流动相纯度。 7. 检查样品中的其他成分。 为什么HPLC分析的样品要过滤?1. 样品过滤保护您的色谱柱, 特别是新的5微米以下粒径填料的色谱柱, 毛细管柱和柱入口筛板, 以防止样品中的颗粒物堵塞色谱柱. 延长柱寿命.2.它防止您的进样阀组件被样品颗粒物损坏、刻划或增加磨损. 最小化仪器的停机时间. 怎样知道液相分离对流动相的pH值敏感？测试方法对流动相pH值变化的灵敏度。不是所有的组分，也不是所有的方法对流动相的pH值敏感。中性组分的保留不受流动相pH值的影响。然而，离子化的组分的保留碱性的和酸性的组分在pH值变化时明显地变化。 碱性组分的保留变化最明显，pH值超过5，而酸性组分的保留变化在pH值3到5之间。因此，如果有碱或酸性组分，则建立一个健全的方法，需要在几个不同的pH值之间，分别作出评价。在保持所有其它条件不变时，改变流动相的pH值，并且测试对分离的影响。 如何减小方法对pH值敏感的复制问题？1. 尝试在低的pH下建立方法。例如, 如果你正在分离碱性组分，使流动相的pH值低于3，此时因pH值的小的变化，其保留受影响很小。通常要使分离不敏感，改变流动相pH值时，至少不超过分析物的pKa的1个pH单位。2. 选择流动相pH值适当的缓冲液。适当的缓冲液的选择，是缓冲液的pH值的范围，与所需要的流动相的pH值相匹配。 也就是说，使用适当含量的缓冲液，通常为25到50 mM, 具有良好的缓冲能力。3. 一定要用同样方式准备流动相，也一定要用同样的方式测试流动相的pH值。例如 反相HPLC色谱柱的推荐再生步骤是什么？1. 取下色谱柱，然后重新连接到色谱仪上，让液体/气体反方向流过色谱柱。 2. 用HPLC 级水冲洗掉盐/缓冲液。 以1毫升/分钟的速度把 25 毫升水泵入色谱柱。3. 用 25 毫升异丙醇冲洗色谱柱。 4. 用 25 毫升二氯甲烷冲洗色谱柱。 5. 用 25 毫升正己烷冲洗色谱柱。 6. 再次用25毫升二氯甲烷冲洗色谱柱。 7. 用25毫升异丙醇冲洗色谱柱。 8. 按正确的流动方向，把色谱柱重新连接到色谱上。 用不含缓冲液的流动相冲洗色谱柱，然后重新倒入缓冲液。 9. 用 25 到 50 毫升流动相平衡色谱柱。 10. 注入标准物或样品，检查性能是否恢复。注释： 对于某些污染色谱柱的残留化合物，二甲基甲酰胺 正相 HPLC 色谱柱的推荐再生步骤是什么？1. 按相反的流动方向，把色谱柱连接到色谱上。 2. 用50毫升 50:50 甲醇：氯仿（methanol:chloroform）溶液冲洗色谱柱。 3. 用50毫升乙酸乙酯（ethyl acetate）冲洗色谱柱。 4. 按正确的流动方向，把色谱柱重新连接到色谱上。 5. 用 50 毫升流动相平衡色谱柱。 6. 注入标准物或样品，检查性能是否恢复。 小心： 总的来说，在考虑更换滤头之前，用适当的溶剂清洁和反冲HPLC色谱柱值得一试。 总是存在这样的风险，就是更换滤头的时候可能会丢失少量的填料，这会降低色谱柱的效率。 此外，极力推荐用 0.5?m串联过滤器捕获微粒材料并且使用适当的强溶剂来清洗色谱柱。 如何正确清洁 GPC HPLC 色谱柱（安全的方法）？反方向冲洗色谱柱，冲洗期间不要连接到检测器并且采用二分之一的推荐流速进行冲洗（让压力保持在推荐最大值以下）。 首先，选择一种可以溶解色谱柱中污染物的溶剂。 大多数 GPC 色谱柱是 PS-DVB ，在使用溶剂之前需要检查溶剂兼容性。 与常规洗提溶剂相比，许多清洁溶剂具有较高的黏性，因此必须采用较低的流速并且需要特别注意压力。阴离子样品能吸附到 PS-DVB上，如果这些样品污染了您的GPC色谱柱，那么建议您使用含盐的清洁溶剂。 查看这种色谱柱适合使用哪类盐。 在某些情况下，根据吸附材料的极性，清洗的时候可能需要使用经过能与有机溶剂相溶的酸性物（蚁酸或醋酸）或碱性物（三羟乙基胺）（检查pH范围）或一些水改性后的有机溶剂。 如果更多的疏水性材料被保留，推荐提高温度并使用适当的有机溶剂。 您需要再一次核对色谱柱允许的最大温度范围。如果仔细地进行清洗，色谱柱不会因为溶剂转换而导致性能下降。 哪类色谱柱会在高于pH 7的酸碱度环境下溶解？市面上销售的许多硅基HPLC填料会在pH 7 条件下溶解，因为硅会在pH 7 条件下溶解。因此，安捷伦开发出一种技术，可以显著降低硅溶解并且扩展硅基色谱柱的可用pH值范围。 ZORBAX Extend-C18 可以在高于pH 8 （甚至高达pH 11.5）的条件下使用。 双齿键合是增强稳定性的关键，同时确保只有硅才能提供的高效率。 如何估计是否出现色谱柱塌陷？首选检查您的方法并确定色谱柱的操作pH值是否超过推荐标准。这可能是色谱柱塌陷的主要原因，因为硅会溶解，从而导致色谱柱塌陷。此时需要考虑样品注射溶剂以及流动相。 如果出现色谱柱塌陷，您会看到色谱图中的每个峰值上，峰形都会发生变化（峰拖尾、加宽或分叉）。 色谱柱塌陷通常不会只让色谱图中的一个峰值发生变化。 此外，通常也不会导致分析物保留度发生变化。 您还可以转动色谱柱，如果出现色谱柱塌陷，那么峰形也应发生变化。检查是否出现色谱柱塌陷的最有效方法就是打开色谱柱，但是这是排除色谱柱故障时最后才能采取的方法。 如果色谱图中的一个峰出现拖尾，但是其它峰正常，可能出现什么故障？由于我不了解样品的化学性和有关流动相或色谱柱的详细情况，所以我很难回答这个问题。峰拖尾可能由多种原因引起，在回答您的问题之前，我想问您几个有关样品的问题。由于您色谱图中大多数峰的形状都是完好的，只有一个峰出现拖尾，我猜想色谱柱和样品的化学性引起二次反应，从而导致峰拖尾。更改流动相或选择另一个HPLC色谱柱能够减少这些二次反应。 能否用一些洗涤剂来清洁HPLC色谱柱？不推荐用洗涤剂来清洁反相（RP）HPLC色谱柱。 离子洗涤剂通常是一端带一个离子化基团的长链碳化合物，一般用作离子配对试剂。 因为这些长碳链能与反相色谱柱的键合相很牢固地结合起来（例如，C18反相色谱柱柱的键合相能牢固地保留洗涤剂的长碳链), 因此很难清除洗涤剂。 有些制造商说可以倒过来使用（较新的）色谱柱，这样能去从色谱柱前面清除堵塞物？ 这是不是常规推荐方法？或者是否取决于色谱柱？HPLC 色谱柱比以前更有效并且填充得更好，因此，通常建议大多少倒相和正相硅基色谱柱采用这个方法。 当色谱柱入口出现高压，可以通过这个方法从色谱柱滤头去除微粒，但是并不是每次都起作用。 由于这不需要打开色谱柱，所以值得一试。 采用这个方法时，一定要从检测器上拆下色谱柱，这样能确保堵塞色谱柱的微粒不会从HPLC系统进入，或者您可以把滤头插到色谱柱的后端，但这可能无法再放回去。 还可以把色谱柱倒转过来，然后用强溶剂清洗/清洁色谱柱，以便去除吸附材料。 这样做有一个好处，就是色谱柱的其余部分不会受污染物影响。 在这个过程中，不要把色谱柱连接到检测器上。 H3PO4清洗 HPLC 色谱柱有什么目的？经证明，磷酸洗涤剂能有效减少由于样品与HPLC系统中的金属络合而导致的拖尾。一般建议用 1% 磷酸来清洗系统和色谱柱，以此消除这种拖尾现象，这很有效。在安捷伦 ZORBAX StableBond 反相 HPLC 产品上使用这些推荐的清洗条件会取得非常理想的效果。StableBond HPLC 色谱柱在低PH条件下性能非常稳定 - SB-C18 色谱柱在 0.8 PH值和 90度条件下可保持稳定。如何肯定峰拖尾是由于金属络合而引起的？只要辨别N或O原子上的孤对电子能否与金属螯合并形成5 或者 6元环。金属络合物是一个普遍被忽视的峰拖尾成因，每个HPLC系统中都存在金属。 能否提供一种与我使用的LC 色谱柱相同的色谱柱？即使用同一种固定相，不同厂商的液相色谱柱也可能具有不同的保留时间。 虽然这里提供了一些不同厂商的色谱柱的参考数据，但这些数据在不同的色谱条件下会有所不同。我们通常根据您的应用情况，向您推荐一种其它的色谱柱。在此之前，我们需要您提供以下信息： 1. 分析物的详细信息（样品的成分和要分析的成分）； 2. 是否可以接受液相色谱条件的改变； 3. 能否对您的方法进行一些调整。 如果您不能接受分析条件和/或保留时间的改变，则应该继续使用目前的色谱柱。 如何选择液相色谱保护柱？保护柱的作用是用来防止分析柱被一些微粒物质堵塞,及在色谱柱上强吸附组分在色谱柱上吸附。为防止样品的杂质不进入色谱分析柱,不出现不必要的峰展宽，保护柱与分析柱的体积比应在 1:15 至 1:25 之间。 在理想的情况下，保护柱的填料应与分析柱相同，以确保得到分析柱较好的色谱图。尽量使保护柱与分析柱近似。在我们的目录里，将分析柱和与其配套的保护柱列在一起。 改变填料颗粒大小和色谱柱的长度对液相色谱分离有什么影响？如果填料颗粒大小减半，则理论塔板数加倍（假设柱长不变）。如果填料颗粒大小减半，则柱压增加为原来的四倍。 如果柱长加倍，则理论塔板数加倍。如果柱长加倍，则分析时间加倍。随着柱长增加，柱压也线性地增加。 以下是一个根据上述信息选择色谱柱的示例： 一个装填 10um 填料的长度为 200mm 的色谱柱可生成 6000 块理论塔板，这是在很多情况下能提供比较适当的分离的色谱柱效率。将颗粒大小由 10um 减小到 5um，柱长仍为 200mm，则可生成 12000 块理论塔板。然而，这个色谱柱可生成相当于原来四倍的柱压。通常情况下不需要生成 12000 块塔板，因此柱长可减半至 100mm，结果生成 6000 块塔板，同时分析时间也缩短一半；柱压仅比最初装填 10um 填料的长度为 200mm 的色谱柱高两倍。 改变色谱柱直径对液相色谱分析有什么影响？如果色谱柱直径减半，则灵敏性增加四到五倍（假设进样量不变）。例如，等量的样品进样到内径为 2.1mm 的色谱柱比进样到内径为 4.6mm 的色谱柱所生成的峰高 5 倍左右。 只要线性流动保持不变，则柱效率、理论塔板数、反压和分析时间等参数均与色谱柱内径的减小无关。 改变填料孔径大小对液相色谱分离有什么影响？填料孔径越小，允许的流动相线速度越高。最佳流动相线速度取决于固定相的颗粒大小。在最佳线速度时，色谱柱生成的理论塔板数最多。对于内径为 4.6mm 的色谱柱，10um 的颗粒流动相线速度为 0.75ml/min 或 5um 的颗粒流动相线速度为 1.5ml/min 时，塔板数最多。 什么原因导致柱效（理论塔板数）下降？与色谱柱有关的原因： 原因处理方法色谱柱出现间断使用类似的填料填充空隙或更换色谱柱保护柱无法再用更换保护柱其他可能的原因： 柱外体积大、进样的样品量大、样品溶剂强度比流动相大、流动相的改变。 什么原因导致液相色谱分析的“神秘峰”？与色谱柱相关的原因： 原因处理方法色谱柱污染清洗或更换色谱柱保护柱失效更换保护柱与色谱柱无关的原因： 流动相不纯、样品里有其他成分、系统里有气泡、电路问题。 如何避免峰拖尾和峰分叉？与色谱柱相关的原因： 原因处理方法色谱柱污染清洗或更换色谱柱色谱柱填料有问题反冲色谱柱或更换进样口过滤片色谱柱出现间断更换色谱柱或填充空隙保护柱失效更换保护柱样品分布差改进色谱柱进样口的设计与色谱柱无关的原因： 超柱体积过大、样品过量、流动相组分（添加剂、pH值、缓冲浓度）改变。 当购买开更新不同批号的色谱柱后如何对分析方法进行测试并确认可用此柱？首先，在色谱柱包装盒的外面找到它的批号。批号的字体比较小，通常在条形码的下面。批号通常以字母“B”开头，后面是 5 位阿拉伯数字。例如，下面示例中的色谱柱批号为 B99091。 如果找不到包装盒，则查看色谱柱标签上的序列号。要从序列号来确定批号，请拨打安捷伦科技公司 HPLC 色谱柱技术支持的电话，号码为 800-820-3278。他们会请公司生产部门来查询批号，同时确定其它哪些批号的色谱柱可用。 获得所需的批号或知道您的批号后，可使用以下步骤进行订购： 1. 通过安捷伦科技公司或首选的经销商进行订购。 2. 使用特殊的部件号 899999-888, 该号码表示此订单是专用色谱柱。 3. 说明要订购的色谱柱的类型、尺寸和填料粒度大小，包括通用部件号。 4. 指出您希望色谱柱是哪个批号，或者哪个批号的色谱柱不能用。 示例说明 部件号 899999-888 Eclipse XDB-C18 分析色谱柱，4.6mm x 250mm，(963967-902) 除了批号为 B99091 和 B99079 的专用色谱柱 用于方法确认目的的色谱柱 StableBond SB-C8 和 Rx-C8 色谱柱有何不同？SB-C18 与 Rx-C18 呢？StableBond SB-C8 与 Rx-C8 没有什么区别。这两种色谱柱是一样的。Rx-C8 色谱柱首次将空间位阻保护键合到纯羟基硅酸上。这种键合使得色谱柱的使用寿命非常长，并且在 pH 值较低生成的峰形较好。键合剂是二异丙基辛基硅烷。二异丙基化合物侧链比较大，因此可以对键合相产生位阻保护以防止被酸水解。空间位阻保护的键合相不断发展，逐渐形成了包含 SB-C18、SB-C8、苯基 SB、SB-CN 和 SB-C3 的一个完整系列。这就是众所周知的 StableBond 系列色谱柱。为了保持一致性，将 SB-C8 加入到此系列中，但是没有取消 Rx-C8，这主要是为了方便目前使用 Rx-C8 的用户。 什么原因导致反相 HPLC 的峰拖尾，应采取什么措施？由于被分析物与色谱柱间的相互作用导致峰拖尾。这种相互作用是在做反相分析中所发生的分配行为以外的作用。峰拖尾一般发生在碱性化合物上，通常是由于残留的硅羟基和带正电荷的碱性化合物之间的相互作用引起的。这种相互作用一般是发生在带正电荷的碱性化合物与带负电荷的色谱柱表面硅羟基之间的离子交换。当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时， 色谱柱表面的硅羟基会带负电荷。因此，消除峰拖尾的最有效方式是使用 pH 值小于 4 的缓冲流动相。由于硅羟基的活性和离子化会降低，因此选择更换新的高纯羟基化硅胶色谱柱也会减少峰拖尾。 ZORBAX 色谱柱中使用这类硅胶的有：StableBond 色谱柱、Eclipse XDB 色谱柱、Bonus-RP 和 Extend-C18 色谱柱。这些色谱柱均可以减少峰拖尾，但是它们又有所不同。StableBond (SB) 色谱柱在低 pH 值时比较理想，因此在使用较低 pH 值的流动相时通常是首选色谱柱。在 pH 值为 5-9 时，Eclipse XDB 色谱柱是减少峰拖尾的首选色谱柱。这类色谱柱有双重封端，因此它可以通过覆盖色谱柱表面上尽可能多的残留硅羟基以消除可能的硅羟基副作用，从而减少峰拖尾。对于这个中间 pH 值区，Bonus-RP 色谱柱也是一个减少峰拖尾的不错选择。Bonus-RP 色谱柱有一个植入极性物质的键合相。这些极性物质可减少碱性化合物和残留硅羟基之间的相互作用，因此改善碱性化合物的峰形。这类色谱柱可以在 pH 值为 2-8 的条件下使用。Extend-C18 用于高 pH 值，最高可用于 pH 值为 11.5 的条件下。在较高 pH 值下，很多碱性化合物已经不带电荷，因此和硅羟基的相互作用减小，峰拖尾也减少。 认真选择流动相也可以减少峰拖尾。缓冲流动相 (2550 mM) 可减少峰拖尾，同时首选低 pH 值 (pH 23) 流动相。这还会产生更多的可再生色谱。如果需要的话，可以添加一些流动相添加剂如三乙胺 (TEA) 以减少碱性化合物的峰拖尾。TEA 相当于竞争物，占据硅羟基的位置，用于消除分析物与残留硅羟基间的相互作用。但在低 pH 值时很少需要这类添加剂，仅在中间 pH 值时才偶尔需要。 如果遇到酸性化合物的峰拖尾，处理过程相同。降低流动相的 pH 值以尽量使酸质子化，然后使用缓冲流动相并尽量增强流动相的离子强度。最后，可以通过向流动相中加入竞争的有机酸，我们已经使用 0.1% 三氟乙酸 (TFA) 得到了比较好的结果，并且这种添加剂具有比较低的紫外截止值。按照这些建议应该可以减少酸性和碱性物质的峰拖尾。 现在大多数色谱柱使用球形粒子，因为这种使用球形粒子填充的色谱柱具有更高的效率。因此，从选择一个球形粒子色谱柱开始。分析分离最常用的粒子大小为 5um，这是因为这种粒子比较容易使用，但现在更佳的选择为 3.5um 的粒子。这些更小的粒子在更短的柱长度内可产生更高的效率，可以在更短的分析时间内进行分离。如果分析时间对于您很重要，则可以考虑选择 ZORBAX 快速分析 (3.5um) 色谱柱以缩短分析时间。这个 4.6 x 150mm，3.5um 的快速分析色谱柱与 4.6 x 250mm， 5um 的色谱柱具有相同的效果，但分析时间却缩短 40%。如果想进一步缩短分析时间，则还可以选择其它时间更短的快速分析色谱柱（75mm、50mm、30mm 和 15mm）。 对色谱柱孔尺寸的选择取决于分析物的分子量。孔尺寸小于 100 的色谱柱可以用于分析分子量小于 4000 的小分子。更大的分子，例如蛋白质和缩氨酸，应选择孔尺寸为 300 的色谱柱进行分析。另外，一些具有大的多环刚性结构的小分子最好采用孔尺寸为 300 的色谱柱。选择合适的孔尺寸非常重要，这是因为大多数键合相停留在粒子孔内，因此仅当分子能够容易迅速地进出孔时，才能获得最佳的停留时间和峰宽。 如何判断是否需要保护柱呢？保护柱用作一个捕集器，捕集多种颗粒物及样品和 HPLC 系统本身带来的强保留组分，它直接安装在分析柱前面。使用保护柱是延长分析柱寿命（有时能提高 3 倍）的比较划算的途径。尤其是分析生物或环境样品时，建议使用保护柱。同时，当分析药物和农用化学品活性成分、中间体样品和配方样品时，保护柱也是很有用的。 为了最大程度发挥保护柱的优点，在保护柱过载和污染物已进入分析柱之前更换保护柱是非常重要的。一些关于保护柱更换频率的向导，另请参见此处。 然而，保护柱并不是预柱过滤器的替代品，我们强烈建议预柱过滤器用于保护色谱柱不受填料、样品、泵密封圈和进样器阀磨损污染。制备柱嵌入式过滤器应安装在保护柱前（如果没有保护柱，直接安装在分析柱前）。Agilent 出售一种死体积很低的嵌入式过滤器，它甚至可以用在快速分析 HT 1.8 微米色谱柱前，仅损失很少的性能。 如何决定何时更换保护柱？许多色谱人员在测试一定数量的样品和标准样后更换保护柱。样品数量通常由实验决定，在长时间未更换保护柱而造成分析柱破损时或样品分析数量增加，而保护柱需要更换。 保护柱的更换频率通常根据经验而定，按照每个方法/样品类型综合考虑，但是许多分析人员会在完成一定数量的样品分析或测试一些柱的性能指标（例如增加 10% 峰展宽或拖尾因子，或降低 10% 的柱效（塔板数）后更换保护柱。 HILIC 是怎样工作的？ HILIC 在二氧化硅方面的机理 极性分析物从吸附性含水涂层分配进去又分离出来。 带电的极性分析物，能够经受同带电的硅烷组分作正离子交换 (取决于pH 值 ) 这些机理相结合建立起增强了的极性保留。 任何这些机理的缺失将使得没有极性保留。 如果发货时含有的溶剂被更换，Agilent标准的 Zorbax 柱可以用于 HILIC 应用。 从非极性的 Heptane 到极性更强的溶剂都可用于 HILIC 应用。 可能使用的 如何清洁 C4 HPLC 色谱柱？与 RP 相色谱柱差不多，如果您使用标准流动相条件来分离小分子，我再介绍一些常规使用说明。 如果分离肽和蛋白质，或者如果样品在血浆中溶解，那么操作步骤就不同，建议您联系安捷伦技术支持获取更多信息，或者联系您当地的安捷伦销售办事处。 什么是HILIC? HILIC 即为亲水性色谱，于1990年从标准的正相色谱中分离出来，成为一个术语(Alpert J.Chromatography, 499 (1990) 177-196) HILIC是正相色谱的一种变种。 对极性很大的物质比反向柱提供了更大的保留。 固定相是一种极性材料，如二氧化硅，cyano, amino, diol,等。 流动相是含有少量的水成物/极性溶剂的有机溶剂。 极性溶剂(象 Acetonitrile, alcohols, water) 提供 填充较短的大口径（7毫米）色谱柱是否能降低柱外体积？只要您愿意在较高的流速下进行操作。 如果以1.0 毫升/分钟的速度在4.6 毫米直径的色谱柱上进行操作，那么采用2.3 毫升/分钟的速度可获得与使用7.0 毫米直径色谱柱相同的线速度。溶剂废液可能成为一个问题。 高分离色谱柱比5 m 色谱柱更容易发生故障。 这是不是真的？不，这种说法不正确。高分离色谱柱 与 5 m和 250 mm 色谱柱一样耐用。 使用小微粒容易发生色谱柱故障主要由两个原因引起。 首先，小微粒色谱柱可能更容易发生堵塞。 但是在色谱柱顶部使用标准的 2 m滤头时，情况并非如此。 由于仔细控制微粒大小和使用 3.5 m 微粒，ZORBAX 高分离度色谱柱不会包含任何 2 m小的微粒。 这意味着，可以在色谱柱上使用标准滤头，这样高分离度色谱柱就不会比 5 m 微粒色谱柱更容易发生堵塞。其次，小微粒色谱柱的使用寿命较短，因为柱床压缩会导致塌陷，从而引发峰加宽和脱尾。 确实，3.5 m 微粒色谱柱比 5 m 色谱柱的操作压力稍高，但是ZORBAX 微粒足以经受住这些增加的压力。 ZORBAX 微粒在 psi下填充，在常规使用中能够经受高达5000 psi的压力。 高分离度 4.6 x 150 3.5 m 色谱柱通常在低于3000 psi的条件下操作，因此在使用ZORBAX高分离度色谱柱时，柱床不会压缩。 因此，在使用高分离度色谱柱时 ，神奇的ZORBAX微粒和标准 2 m 色谱柱滤头可确保较长的色谱柱使用寿命。这种超短的高分离度色谱柱还能在高流速条件下使用，从而进一步缩短分析时间。 是否可以通过某种“普通的”色谱柱实验来跟踪HPLC色谱柱的性能？ 应该多长时间执行一次这种实验？根据我的观点，评估色谱柱性能的最佳方法就是使用每根HPLC色谱柱配套提供的QC测试。 通过对比样品中峰的效率、保留时间和峰形，最重要的是这些实验条件下的压力，您可以了解色谱柱的性能是否发生变化。 这些实验还能告诉您色谱柱的哪些性能发生变化，因为我们用相同的方法来诊断色谱柱故障。 保留时间出现明显变化表明键合相丢失，峰宽/效率和压力出现明显变化表明色谱柱受污染。 峰宽和效率急剧减少表明色谱柱塌陷。大多数制造商采用类似的溶质和流动相实验条件来对他们的色谱柱进行QC实验。 然而，不同的键合相需要改变有机改性剂的用量，以便获得适当的保留时间。重要的是，您应先在系统上对色谱柱进行QC实验，然后再将其应用于特定的项目。 这样您就能了解色谱柱在系统上的性能，然后再开始注射样品，这样能避免发生问题。 如果出现问题，利用这个QC实验来检查HPLC系统和色谱柱是否运行良好。 不再使用色谱柱时，清洗色谱柱并进行QC实验。 不管出于何种原因，如果您准备拿一根用过的色谱柱开展项目研究，至少应该先对色谱柱进行QC实验，然后再注射样品。 能否把安捷伦 1100 系列 HPLC系统应用于交替柱再生？可以。 您需要升级套件 - 2PS/10PT 阀套件（零件号 G1316-68709 或者 G1316A 选项#057），以便升级现有的自动调温柱室。新升