生物药剂学与药物动力学实验讲义 电子版.doc

生物药剂学与药物动力学实验实验一 片剂溶出度的测定实验目的1了解溶出度测定在药物评价中的意义和应用。2掌握片剂溶出度测定的方法。3 熟悉溶出度测定结果的分析和统计学评价力法 实验提示 溶出度(dissolution)系指药物从片剂、胶囊剂或颗粒剂等固体制剂在规定溶出介质中溶出的速度和程度。 固体口服制剂中药物能否被吸收是药物能否发挥临床效应的英关键，而药物从制剂中镕出的速度和程度则是影响吸收的重要因素，这与药物的起效时间、药效强度和持续时间都有密切关系。对一些难溶性的药物和消出速度慢的药物来说，药物从固体制剂中溶解、释放速度慢，溶出速度成为吸收的限速过程。因此，溶出度的测定对固体口服制剂的内在质量的评价具有重要的意义。对于同一药物不同配方口服固体制剂溶出度的测定比较还可以反映出药物与赋形剂和制剂工艺之间的关系，探索溶出度、生物利用度和临床效应之间的关系，为口服固体制剂配方筛选、工艺优化以及质量控制指标与方法的建立提供有力的凭证。 1965年，美国药典USP(）首先收载溶出度/释放度测定方法；国内自20世纪70年代中期开始进行溶出度/释放度研究，中国药典（2000版）中要求进行溶出度/释放度检查的品种已达183个。 在新药口服固体制剂的研究中，对药物的溶出/释放行为考察已成为不可缺少的内容。经过近半个世纪的发展溶出度的测定方法已经比较成熟，测定设备也趋于标准化和自动化，使该实验的科学性、灵敏度、重现性和实用性都大幅度提高。中国药典最新版“溶出度测定法”收载了二种方法，并对其仪器装置、测定方法、结果判断都做了详细规定。本实验选用常用的、与体内试验有较好相关性的方法之一转篮法(即中国药典溶出度法“第一法”)测定甲、乙两厂不同配方甲硝唑片在规定时间点的溶出度，通过威布尔概率拟合求算T50、Td、m、3个参数并采用方差分析对实验结果进行统计评价。【方法与步骤】 (一)不同厂家出产的甲硝唑片的含量测定 分别取不同厂家出产的甲硝唑片10片，准确称量研碎磨细，精密称取相当于一片量的细粉（W含），加约600ml人工胃液搅拌使其溶解，移入1000ml容量瓶中，定容。混匀后过滤，精密吸取续滤液1ml于10ml具塞玻璃试管中，加9ml人工胃液。混匀。以人工胃液为空白，采用紫外一可见光分光光度法测定吸光度(A含），检测波长为277nm，记录结果。 (二）不同厂家生产的甲硝唑片溶出度测定1药物溶出度测定仪的调试与使用：实验前溶出仪已安装完备并经过调试，整机及主要部件如图所示。（1）预热：打开电源开关，在水浴恒温控制面板(A)处，使用或键将水浴的预置温度设定为37，随后温度显示窗将显示出水浴的实测温度。按一次启/停键，“温控状态指示灯”亮，水浴开始循环升温，直至达到预置温度，并保持恒定。 （2）安装转杆，调节转篮高度：仰起机头，将已清洗干净的玻璃溶出杯(1000ml，小杯法为250m1)放入水浴箱上溶出杯孔中，固定。将转杆向下向上插入机头的转轴孔中，安上转篮，从浆杆上端套入离合器。注意，离合器不要拧紧。将定高环(直径25mm，小杯法为15mm)放入溶出杯至杯底中心处。放下机头，垂直下压转杆顶端使转篮底部与定高环顶部轻微接触（B），旋紧离合器到刚能夹住转杆的程度，向上提起转杆，然后固定离合器下部与转秆的相对位置，顺时针旋紧离合器上部螺母即可。 （3）加入溶出介质，设定转速：量取经脱气处理的溶出介质(本实验为人工胃液)900ml注入溶出杯中：在转速控制面板（C）处使用或键设定转速为50r/min。 (4)待溶出介质达到设定定温度，将待测药物放入转篮，连接转篮与转杆，垂直下压转杆顶端，直至离合器下部压住同步齿轮为止，按转速校制面板处启/停键，“运动状态指示灯”亮，此刻时间控制面板(D)处开始计时。 2.溶出度测定：将精密称定质量的药片1片投入干燥转篮内按上面第(4)步所述操作，开始测定。分别于规定时间取样。取样时间甲厂和乙厂产品均为1min、3min、5min、10min、20min、30min、40min。取样时间用5ml注射器通过取样针从溶出杯中抽取样液5ml,并迅速补充5ml人工胃液至溶出杯中。取出的样液以0.8m微孔滤膜过滤，续滤液放入塑料离心管中(取样至过滤应在30s内完成)，再精密移取1ml于10ml具塞玻璃试管中，加9ml人工胃液以人工胃液为空白，于277nm处测定吸光度(A释)，记录结果。 实验数据与处理 1甲硝唑片溶出度实验结果：实验中溶山度的近似计算公式为 各小组将测定结果记录于表中，计算各个取样点的溶出度，并算出所得实验组所得溶出度的均值。以F(%)值对溶出时间t作图,即可得溶出曲线。求算各实验小组数据之间的标准偏差(S)和变异系数(CV或RSD)。2.威布尔概率拟合求算甲硝唑片的体外释放参数：T50为固体口服制剂主药累积溶出量为50时所需时间，将溶出数据以F为纵坐标，t为横坐标描点后得到F-t溶出曲线，曲线中取F值为50%处向t轴做一垂绝与t轴交点所对应的时间即为T50. F-t 溶出度曲线 以溶出/释放曲线摄取参数是一种简单且直接的获取药物溶出/释放体外参数的方法。此外，根据固体制剂溶出/释放的规律，还可以采用一些数学模型如单指数模型、对数正态分布模型、Higuchi方程、Ritger-Peppas模型、威布尔(Weibull)分布模型模拟药物的溶出行为，进一步探寻药物的溶出规律。本文验采用威布尔分布模型来求算甲硝唑片的溶出参数，F（t）轴表示累积溶出度，t轴为溶出时间，以实验数据描点。若各点基本上呈直线分布，则可以拟合出一条直线；苦不呈直线分布，则将各点以一条平沿曲线连接，如下图所示，该曲线延长交t轴于a1(此即所谓的滞后时间)。 威布尔模型模拟合示意图 将原溶出时间减去滞后时间得到修正后的溶出时间t(tn=tn-a1)，用新的时间点t与F（t）再描点，所得各点若仍不呈直线分布，则两次如上作图可得到a2，如此求得t”=t-a2，再以t”与F（t）描点作图直至能拟合出一条直线为止，上图中AB既为最终拟合直线B点为该直线与x轴的交点。M点为咸市尔概率纸中一固定点过M点作直线AB的平行线与Y铀相交与C点。过C点向In In 轴引垂线，其交点绝对值即为m。过B向t轴引垂线其交点即为Td。Td为固体口服制剂主药累积容以量为63.2%时所需时间。拟合直线AB上F(t)50所对应的时间即为T50，求得的参数填入下表。3. 实验数据的方差分析：本实验将不同厂家的配方看作影响甲硝唑片溶出度的主要因素，因而采用单因素方差分析进行计算，两个厂家的配方作为该因素的不同水平对每一种片剂5组所得的T50为同水平下的实验值以F检验考察它们之间在检验水准为0.05时是否有显著性差异。测定数据记录于下表。(1)建立检验假设：H0，1=2(甲、乙两厂生产的甲硝唑片溶出行为相同)：H1，12(甲、乙两厂生产的甲硝唑片溶出行为不相同）。确定检验水准0.05。(2)计算检验统计量。 将计算所得统计量填入下表中。 （3）确定P值做出统计推断：查F界值表得到对应的F0.05。已知P=0.05时F0.05(1.8)5.32。若FF0.05，P0.05，按=0.05水平拒绝H0，接受H1，可认为甲、乙两厂生产的甲硝唑片的溶出行为不同；若FF0.05，P0.05，按=0.05水平不拒绝H0，尚不能认为甲、乙两厂生产的甲硝唑片的溶出行为不同。 【结果与结论】列表、作图表示实验结果并根据以上数据处理和统计学分析对实验做出合理结论。【思考题】1.溶出度的测定在固体口服制剂的质量评价中有何意义?2.用溶出仪测定片剂溶出度的操作中应注意什么问题？3.在配方没计和制剂工艺中影响片剂溶出度的出素有哪些?4.在溶出度实验，影响片剂溶比度测定的因素有哪些?实验二 大鼠在体小肠吸收实验【实验目的】1. 掌握大鼠在体小肠吸收的实验方法。2. 掌握计算药物的吸收速度常数（Ka）、吸收半衰期（t1/2）及每小时吸收率的计算方法。【原理】 被动扩散是消化管吸收的最重要途径，是药物分子通过胃肠屏障从浓度高的区域（吸收部位）向浓度低的区域（血液）扩散，从电势高的区域向电势低的区域移动，不消耗生物体的能量，只与浓度有关。其扩散速度与膜两侧的浓度差成正比。Fick方程式定量地描述了这一过程：式中，dQ/dt为分子型药物的透过速度；S为膜的面积；D为膜内的扩散速度常数；K为膜物质/水溶液的分配系数；C为消化液中的药物浓度（外部浓度）；C0为血液中的药物浓度（内部浓度）；X为膜的厚度；P=DK成为透过常数。一般药物进入循环系统后，立即转运至全身，故药物在吸收部位循环液中的浓度相当低，可以忽略不计。因此，透过速度与消化液中的药物浓度成正比。若设PS/X=Ka，则式可以简化为由式可看出，药物的透过速度属于表观一级速度过程。若以消化液中药物量的变化dX/dT表示头过度，则将式积分，得以时间t对小肠内残存的InX作图应为一直线，该直线的斜率即为药物在小肠中的吸收速度常数Ka。【试剂与器材】蠕动泵，红外灯，721型比色计。0.1%NaNO2，0.5%NH2SO3NH4，0.1%二盐酸萘乙二胺液（以上3种溶液置冰箱保存），1mol/L HCl，0.2mol/L NaOH，生理盐水，10g/L巴比妥钠溶液。Krebs-Ringer试液：NaCl 17.8g，KCl 0.35g，CaCl2 0.37g，NaHCO3 1.37g，NaHP2O4 0.32g，MgCl 0.02g，葡萄糖1.4g，用水溶解并加至1000ml。【方法与步骤】1操作：取50ml供试液（100ml Krebs-Ringer试液含磺胺嘧啶2mg，酚红2mg）加入循环装置的锥形瓶中。将实验前禁食一夜，体重200g左右的雄性大鼠腹腔注射巴比妥钠（40mg/kg），麻醉并固定，沿腹中线打开腹腔（约3cm长）。自十二指肠上部（胃作标志）及回肠末端（回盲部作标志）各插入直径适当的玻璃管或硬塑料管，用丝线扎紧，并用37的生理盐水将小肠内容物洗净。将玻璃管与装置中A、B两胶管连接，开动蠕动泵，以5ml/min流速循环10min，将流速调至2.5ml/min，自烧瓶中取样1.5ml（1ml、0.5ml各一份）为药物（SD）和酚红零时间样品，并补加酚红液（100ml Krebs-Ringer试液含酚红2mg），其后每15min取样一次（1ml、0.5ml各一份），同时补加酚红溶液2ml。取样前后，均将溶液摇匀。由于酚红不被小肠吸收，当小肠吸收水分后，酚红被浓缩，以此测定小肠吸收水分的量（装置图见图2-8-2-1）。实验结束后，从两处插管处剪下小肠，冲洗后剖开，摊于坐标纸上，沿小肠边缘剪下坐标纸，冲洗并烘干小肠，称重（W1）并剪取10格(W2)，小肠面积即可求出：2.磺胺嘧啶和酚红的定量。（1）磺胺嘧啶定量：样品1ml、1mol/L HCl 5ml、0.1%NaNO2 1ml，摇匀，放置3min；加0.5%NH2SO3 1ml，放置3min；加0.1%二盐酸萘乙二胺2ml，放置20min；于550nm测定吸光度。磺胺嘧啶比色空白液为1ml，供试液按上法但不加萘乙胺显色剂。（2）酚红定量：样品0.5ml、0.2mol/L NaOH 5ml摇匀，于550nm测定吸光度。酚红比色空白液为0.2mol/L NaOH。（3）标准曲线制作。酚红标准曲线：精密称取酚红100mg，加1%NaCO3溶解，置1000ml容量瓶内，稀释至刻度，得100mg/L的标准溶液。取该标准溶液2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，加蒸馏水至10ml。取0.5ml按酚红定量法测定吸光度，并绘制标准曲线。磺胺嘧啶标准曲线：自2%供试液中吸取2ml、4ml、6ml、8ml、10ml，加蒸馏水至10ml，取1ml按磺胺嘧啶定量法测定吸光度，并绘制标准曲线。【实验结果及数据处理】以剩余药量的对数和取样时间作图，求出吸收速度常数ka、吸收半衰期t1/2和每小时吸收率（%）。大鼠在体小肠吸收量计算式：根据小场面及计算1hcm2（或1h100cm2）的吸收率。装置如图2-8-2-1所示。实验三 肌内注射青霉素G钾动力学研究【实验目的】1. 掌握采用HPLC测定青霉素G钾血药浓度的方法，了解高效液相色谱仪的应用。2. 掌握一室模型药物动力学的参数求算。3. 验证青霉素G钾药物动力学模型。【原理】血浆样品的处理采用HClO4溶液直接沉淀蛋白质，用HPLC外标法定量测定青霉素酸（青霉素水解产物）。给受试动物肌内注射青霉素G钾后，该药在体内分布较快，呈一室模型动力学特点。【试剂与器材】高效液相色谱仪（紫外检测器）、色谱柱。流动相：取甲醇400ml，加600ml磷酸盐缓冲液（H2PO4 14ml,KH2PO433.5g，溶于5000ml蒸馏水中），内含0.02mol/L四丁基氯化铵。0.33mol/L HClO4：取70%72% HClO45.67ml，加蒸馏水至200ml。青霉素G钾标准溶液：取青霉素G钾约24mg（4105u），精密称定，加蒸馏水溶解并稀释至100ml，即得。【方法与步骤】1. 确定青霉素的保留时间。（1） 空白对照液的制备：取0.5ml空白血浆（肝素抗凝）置离心管中，加1.0ml 0.33mol/L HClO4，用旋涡混合器混合均匀，离心（10000r/min）5min，取上清液50l进样，记录各峰面积（A）和保留时间（t）。色谱条件：流速0.9ml/min；波长245nm；柱温30。（2） 青霉素G钾样品液的制备：取0.5ml空白血浆置离心管中，加20l青霉素G钾标准液，加1.0ml 0.33mol/L HClO4，其余操作同（1）。2. 标准曲线的制作：取离心管5支，各加入空白血浆0.5ml，依次加青霉素G钾标准溶液20l、40l、80l、150l、200l。按步骤（1）自“加上1.0ml 0.33mol/L HClO4”起操作，记录各样品青霉素G钾的峰面积（A）填入表2-8-3-1。以C为横坐标，A为纵坐标描点，绘制标准曲线，并拟合求出直线方程：A=a+bC。3. 给药及采样：取2.5kg左右的健康家兔，按192mg/kg计算给药剂量，股四头肌注射青霉素G钾（用1ml蒸馏水溶解后注射）。分别于注射后5min、10min、15min、20min、25min、35min、45min、60min、90min、120min于耳静脉取血2ml，置肝素化离心管中，离心（10000r/min）5min，分别上层血浆待测。4. 血药浓度测定：取含药血浆0.5ml置离心管中，加0.33 mol/L HClO4 1.0mg/ml；其余操作同标准曲线的制作。结果计算：测得血浆样品的A，代入标准曲线方程计算血药浓度（C）。C=（A-a）/b【数据处理】1. 列数据表2-8-3-2。2. 作图：在坐标纸上以lgC为纵坐标，取样时间t为横坐标描点作图。3. 计算参数：用剩余法或图解法求算动力学参数K、Ka、t1/2、V（假设生物利用度为1）。实验六 血药法测定对乙酰氨基酚片的生物利用度【实验目的】1 掌握血药法测定固体口服制剂生物利用度的原理及方法。2 掌握药动学参数的求算。3 熟悉生物利用度在药物评价中的意义。4 了解血清生物样品的处理方法。【试剂与器材】10ml、20ml具塞离心管，1ml、5ml、10ml刻度吸管，滴管，玻璃漏斗，5ml塑料离心管。紫外-可见风光光度计。滤纸，试管架，刀片，塑料夹，酒精棉球，脱脂棉，注射器、注射针头、兔盒等。0.12mol/L Ba（OH）2：取分析纯Ba（OH）2 19g，加新鲜煮沸放冷的蒸馏水溶解并稀释至1000ml，静置过夜，过滤即得。2%ZnSO4：取分析出ZnSO4 20g，加蒸馏水溶解并稀释至1000ml。【方法与步骤】1. 空白血样的采集：取体重3kg左右家兔一只，心脏取血约30ml，置于10ml塑料离心管中，37水浴中保温1h，以3000r/min离心10min，取空白血清供标准曲线制备用。2. 标准曲线制作：精密称取扑热息痛对照品50mg，用适量蒸馏水溶解，置100ml容量瓶中，以蒸馏水添加至刻度。摇匀，即成100mg/L的标准溶液。分别按表2-8-6-1中“标准液取量”取标准溶液并置于20ml具塞试管中，分别加定量蒸馏水至10ml，然后各加上述血清1ml混匀，再各加0.12mol/L Ba（OH）2 4.5ml,混匀，放置2min，再分别加入2% ZnSO4 4.5ml，轻轻混匀，即出现明显乳状浑浊。用双层滤纸过滤，去初滤