免疫原与抗血清制备技术.ppt

免疫原和抗血清制备技术 第一节免疫原的制备第二节免疫血清的制备第三节抗体的纯化和鉴定 第一节免疫原的制备 一 细胞性抗原的制备二 可溶性抗原制备及鉴定三 半抗原免疫原的制备四 佐剂 绵羊红细胞的制备流程图 摇动15 20min 4 可保存3周 取适量 NS洗涤3次2000r min10min NS稀释至2 5 细菌细胞抗原的制备流程图 液体培养或斜面培养37 24h 100 水浴2 2 5h杀菌 无菌试验 NS稀释成8 10亿 ml O菌体抗原 返回 来源 组织和细胞 其成分比较复杂 1 组织和细胞成分混合抗原制备2 蛋白质抗原制备3 核酸抗原制备4 类脂多糖抗原制备5 免疫球蛋白片段制备6 纯化抗原的鉴定 二 可溶性抗原制备及鉴定 可溶性抗原 蛋白质 糖蛋白 脂蛋白 酶类 补体 脂多糖 细菌外毒素和核酸 二 可溶性抗原制备及鉴定 返回 组织和细胞成分混合抗原制备程序 上清液澄清 所用材料必须是新鲜或低温保存的 去除包膜或结缔组织 脏器进行灌洗 洗去血迹及污物 NS内含0 5g LNaN2 冷浴中组织剪碎 装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液 3000r min 10min 取上清液 去除细胞碎片及微小组织 离心 细胞破碎技术及评价 1 酶处理法2 冻融法3 超声破碎法4 表面活性剂处理 细胞破碎技术及评价 常用酶类 溶菌酶 纤维素酶 蜗牛酶等 1 酶处理法 1 酶处理法 方法 在一定的条件下 能消化细菌和组织细胞 特点 此法适用多种微生物 具有作用条件温和 内含物成分不易受到破坏 细胞壁损坏的程度可以控制 2 冻融法 原理 因突然冷冻 细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞 2 冻融法 完 方法 将待破碎的细胞置冰箱内冻结 然后缓慢融化 如此反复两次 大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破 特点 此法适用于组织细胞 对微生物细胞作用较差 3 超声破碎法 原理 利用超声波的机械振动而使细胞破碎 由于超声波发生空化作用 cavitation 使得液体形成局部减压引起液体内部发生流动 漩涡生成与消失时 产生很大的压力 使细胞破碎 超声波使用的频率从1kHz 20kHz不等 间歇进行 避免长期超声产热 导致抗原破坏 3 超声破碎法 特点 操作简单 重复性较好 节省时间 多用于微生物和组织细胞的破碎 4 表面活性剂处理 原理 在适当的温度 pH及低离子强度的条件下 表面活性剂能与脂蛋白形成微泡 使膜的渗透性改变或使之溶解 4 表面活性剂处理 常用的有 十二烷基硫酸钠 SDS 阴离子型 二乙胺十六烷基溴 阳离子型 聚山梨酯 非离子型 新洁尔灭等 应用 破碎细菌 且作用比较温和 提取核酸时 常用此法破碎细胞 蛋白质抗原制备 蛋白质是良好的抗原 要制备特异性高的抗血清通常需要纯化 可采用 1 超速离心法2 选择性沉淀法3 凝胶层析法4 离子交换层析法5 亲合层析法 蛋白质抗原制备 1 超速离心法 原理 利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同 使具有不同沉降速度的颗粒 处于不同密度的梯度层内 达到彼此分离的目的 1 超速离心法 特点 用超速离心或梯度密度离心法纯化抗原 极难将某一抗原成分分离出来 应用 用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原物质的分离 如IgM C1q 甲状腺球蛋白 载脂蛋白A B等 2 选择性沉淀法 原理 根据各蛋白质理化特性的差异 采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀 从而达到纯化的目的 2 选择性沉淀法 常用方法 盐析沉淀法 不同盐浓度则溶解度不同 常用33 50 饱和度的硫酸胺 特点 简单方便 纯度不高 粗提球蛋白 应用 在大量制备中先用此法粗提 再纯化 3 凝胶层析法 凝胶过滤法 原理 凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质 经适当溶液平衡后 装入层析柱 当含有各种分子大小不一的混合物加在凝胶床面时 大分子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内 在凝胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床 短时间内被洗脱出来 而分子较小的物质则进入凝胶网孔结构内 反复受到阻滞 洗脱较慢 分成大 中 小三种类型 3 凝胶层析法 凝胶过滤法 4 离子交换层析法 原理 利用带离子基团的纤维素或凝胶 吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原 各种蛋白质的等电点不同 所带电荷不同 与纤维素结合的能力有差别 当梯度洗脱时 逐步增加流动相的离子强度 使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置 从而使血清中的蛋白质分成 球蛋白 球蛋白 球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来 达到分离纯化的目的 4 离子交换层析法 5 亲和层析法 亲和色谱 原理 依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术 将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上 制成免疫吸附层析柱 当样品流过此柱时 待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体 抗IgG 结合 当改变洗脱条件可重新解离 将待分离的Ig洗脱下来 达到纯化的目的 优点 提取纯度高 抗原抗体不失活性 5 亲和层析法 亲和色谱 正常细胞 标记细胞洗滴 标记细胞被酶裂解 加入特异性抗体 其它蛋白洗涤流失 SDS PAGE分离蛋白 亲和层析法示意图 核酸抗原制备 大分子的核酸具有免疫原性 提取核酸的主要步骤 核酸抗原制备 破碎细胞 核酸从细胞中游离出来 酸沉淀核 除去蛋白质 乙醇 酚和氯仿 类脂多糖抗原制备 苯酚法提取LPS 干燥菌体或湿菌体 水中混匀 激烈搅匀加热5min 冰水急冷 降至10 以下 离心 上层的水层 含LPS 下层的酚层菌体残渣于底部 吸取水层 透析除酚 加热 超速离心 浓缩 LPS在上层沉淀的透明胶状部内 绞出 悬于水中 离心 得纯化LPS 类脂多糖抗原制备 同温的苯酚 免疫球蛋白片段制备 1 酶裂解法酶对免疫球蛋白的水解有极好的专一性 不同的酶可将免疫球蛋白裂解为不同的片段 免疫球蛋白片段制备 2 氧化法和还原法是将免疫球蛋白轻 重链分开的两种常用方法 3 还可用强变性剂或利用改变pH将免疫球蛋白亚单位分开 酶水解免疫球蛋白示意图 Fc段 用以制备抗重链血清 F ab 2 常作为抗体试剂用于试验 木瓜蛋白酶 papain 胰蛋白酶 pepsin 胃蛋白酶 pepsin 1 氧化法 优点是切开后 肽链不能重新形成二硫键 便于肽链纯化 缺点是色氨酸侧链容易被破坏 氧化法和还原法评价 返回 2 还原法 将二硫键还原成琉基 但极不稳定 易重新形成二硫键 必须及时用碘乙酸或碘化酰胺进行羧甲基化 纯化抗原的鉴定 1 含量鉴定2 理化性质鉴定 凝胶层析技术测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶管状电泳 超速离心3 纯度鉴定常用醋酸纤维膜电泳4 免疫活性鉴定常用双向琼脂扩散试验 纯化抗原的鉴定 蓝色 1 含量鉴定 在一定范围内 颜色深浅与蛋白质浓度呈直线相关 方法 酚试剂法鉴定主要试剂 磷钼酸 钨酸的混合酸原理 蛋白质中的酪氨酸 半胱氨酸 色氨酸等能 钨酸 钼酸 还原 3H2OP205 13WO3 5MoO3 10H20和3H2P205 14WO3 4MoO3 10H20 络合物的双缩脲法 蛋白质 Ca2 碱性 加深 含量鉴定 蓝色 理化性质鉴定 已知分子量的标准品 测未知分子量 将样品在同一凝胶柱上 同一条件下层析 洗脱 测保留体积 并查出分子量 此法简便 样品用量少 有一定的实用价值 凝胶柱 保留体积 分子量的对数 2 理化性质鉴定 绘制标准曲线 凝胶层析技术进行测定 垂直电泳 聚合成大分子凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 有分子筛效应 电荷效应及浓缩效应 能精确地分离和鉴定高分子物质 PAG的分子筛效应测定蛋白质抗原的分子量 原理 双丙烯酰胺N N methylenebisacrylamide Bis 丙烯酰胺 acrylamide Acr 催化剂 3 纯度鉴定 方法 醋酸纤维膜电泳进行鉴定 返回 纯度鉴定 原理 蛋白质在一定pH下都带有电荷 由于各种蛋白质等电点不同 分子量也异 因此所带电量也各不相同 在外加直流电场的作用下 它们泳动的速度不同 经一段时间后即可彼此分开 形成电泳谱 从而判断蛋白质抗原的纯度 特点 快速简便 三 半抗原免疫原的制备 1 半抗原 低分子量的化学物质 例如多糖 多肽 甾族激素 脂肪胺 类脂质 核苷 某些药物 包括抗生素 及其他化学物品等 三 半抗原免疫原制备 2 载体 蛋白质类多肽聚合物大分子聚合物 3 半抗原 载体连接方法 载体类型 1 蛋白质 人血清白蛋白 牛血清白蛋白 兔血清白蛋白 牛甲状腺球蛋白等 载体类型 2 多肽聚合物 人工合成的 常见的有多聚赖氨酸 其分子量大 可达十几万到几十万 这种多聚物和半抗原结合后 可刺激免疫动物产生高效价 高亲和力的抗体 3 大聚合物 羧甲基纤维素 聚乙烯吡咯烷酮等 可与半抗原结合 加入弗氏完全佐剂亦可诱发动物产生抗体 半抗原 载体连接方法1 碳化二亚胺法 R NH CH R 半抗原 载体蛋白质 搅拌1 2h 室温24h 透吸除去未反应的半抗原 人工免疫原 半抗原载体连接方法1 混合 混合 半抗原 载体连接方法2 戊二醛法 半抗原 NH2 载体蛋白 NH2 半抗原 N CH CH2 3 CH NH 载体蛋白 OHC CH2 3 CHO 戊二醛是常用的带有两个活性基团的双功能联接剂 半抗原载体连接方法2 半抗原 载体连接方法3 氯甲酸异丁脂法 半抗原 COOH 载体蛋白 NH2 Cl COO CH2CH CH3 2 半抗原 COO COO CH2CH CH3 2 半抗原 CO NH 载体蛋白 半抗原载体连接方法3 简便 用于类固醇抗原制备 HO CH2CH CH3 2 半抗原 载体连接方法4 琥珀酸酐法 用于不含羧基衍生物半抗原制备 半抗原 CH2OH CH2 COCH2 CO 带羧基的半抗原琥珀酸衍生物 半抗原 CH2 OOC CH2 CH2 COOH 返回 吡啶 再经氯甲酸异丁脂法或碳化二亚胺法制备载体半抗原 半抗原载体连接方法4 四 佐剂 概念 与抗原同时或预先注射于机体 能增加机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质 四 佐剂 条件 增加抗原的表面积 改变抗原的活性基团构型 佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间 可直接或间接激活免疫活性细胞 无毒性或无副作用 二 常用佐剂的种类和制备 1 氢氧化铝佐剂 5 硫酸铝 5 氢氧化钠 氢氧化铝沉淀 制成悬液即为佐剂 强烈搅拌 NS洗二次 NS 等体积抗原 免疫接种 二 常用佐剂的种类和制备 2 明矾佐剂 10 硫酸钾铝 氢氧化钠校正pH值至6 5 沉淀 乳状悬液 明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射 皮下注射易引起肉芽种和脓肿 NS搅拌 NS洗二次 离心 抗原 备用 防腐剂 作用大于不完全佐剂局部形成肉芽种和溃疡不能用于人体 弗氏完全佐剂 3 弗氏佐剂 Freundadjuvant 液体石蜡 完全乳化 备用 高压灭菌 加热 抗原 弗氏不完全佐剂 卡介苗 羊毛脂 鉴定 一滴乳剂 乳剂不散浮于液面 水中 混合 4 佐剂应用原则和评价 目的 增强抗原对机体的免疫原性 增强抗体的产生能力 为制备出高效价的免疫血清 增强可溶性抗原的免疫原性 在某种情况下 改变Ag免疫应答类型 延长抗原在免疫动物的时间 改变抗原的分布 增强局部对变应原的超敏反情况 4 佐剂应用原则和评价 应用佐剂的缺点 佐剂常混有微量其它物质 这些物质进入体内后也可引起抗体的产主 影响抗血清的特异性 应用佐剂的缺点 注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌性脓肿 反复注射 易发生超敏反应 使局部组织坏死 甚至引起动物死亡 第二节免疫血清的制备 1 免疫动物选择2 免疫方法3 动物采血法4 免疫血清的分离及保存 一 免疫动物选择 能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类 兔 绵羊 豚鼠 鸡 山羊和马 一 免疫动物选择 1 抗原与免疫动物种属差异越远越好 2 动物必须适龄 健壮 无感染的正常动物 体重合乎要求 3 不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答 4 按需要量选择大小不同的动物 二 免疫方法 3 免疫方案 全量免疫法 弗氏佐剂抗原多次注射 微量免疫法 卡介苗7天弗氏佐剂1月抗原 混合免疫法 综合皮下 淋巴结和静脉 二 免疫方法 1 免疫原的注射剂量 2 免疫途径 免疫反应产生速度依次为静脉 腹腔 肌肉 皮下 皮内 淋巴结 足掌 三 动物采血法 1 颈动脉放血法 最常用的方法2 心脏采血法 要求操作熟练3 静脉采血法 1 4 保存 可保存3 6个月2 低温保存 20 40 可保存2 3年3 冰冻干燥保存 可保存3 5年 三 动物采血法 四 免疫血清的分离和保存 第三节抗体的纯化和鉴定 1 抗体特异性的纯化2 特异性IgG类抗体的纯化3 特异性抗体的鉴定 一 抗体特异性的纯化 1 亲合层析法 将交叉抗原交联到Sepharose4B上 装柱后 将预吸收的抗体通过亲合层析柱 杂抗体吸附在柱上 流出液则是特异性抗体 一 抗体特异性的纯化 2 吸附法 利用不含特异性抗原的抗原液 直接加到免疫血清中 抗原则与抗体结合 上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体 二 特异性IgG类抗体的纯化 1 盐吸沉淀法 经硫酸铵盐吸提取 球蛋白3次 基本为IgG类抗体 但不纯 二 特异性IgG类抗体的纯化 2 A蛋白亲和层析 SPA与IgG的Fc段有很强的特异性的亲和力 细菌表面不同位点独立地与抗体结合 一个A蛋白至少可以结合二个IgG分子 适合纯化细胞培养上清中的McAb 3 其它 凝胶过滤 离子交换层析等 三 特异性抗体的鉴定 1 抗体效价的鉴定 即为抗体活性滴定 三 特异性抗体的鉴定 2 抗体特异性鉴定